In Vivo Nanopatterning von Membranproteinen

Die spezifische Aktivierung von T Zellen beginnt im Kontaktbereich mit der Antigen-präsentierenden Zelle, der sogenannten immunologischen Synapse. Der T Zell-Rezeptor erkennt sein Antigen, das durch MHCII Moleküle auf der Antigen-präsentierenden Zelle präsentiert wird, wodurch eine Vielzahl von hochregulierten Protein- Interaktionen ausgelöst wird. Die Frühphase der Signalisierung geht einher mit der räumlichen Reorganisation von Proteinen innerhalb der Synapse, was zu einer Trennung in "microcluster" und "supramolecular activation cluster" führt. Zurzeit werden Interaktionen durch die Kolokalisation von Proteinen in der sich ausbildenden Synapse via Zweifarb-Fluoreszenzmikroskopie detektiert. Allerdings misst diese Methode die Interaktion nicht per se, und ist daher sehr anfällig auf falsch positive Ergebnisse. Wir möchten in diesem Projekt die Interaktionen zwischen Proteinen während der frühen T Zellaktivierung direkt messen, indem wir einen der Interaktionspartner ("Bait") geringfügig in der Migration bremsen, und die gleichzeitige Verzögerung eines zweiten Fluoreszenz-markierten Proteins ("Prey") detektieren. Die Idee basiert auf einer Methode, die vor kurzem bei uns eingeführt wurde, um Interaktionen zwischen Proteinen in der Plasmamembran von lebenden Zellen zu untersuchen (Schwarzenbacher et al., Nat. Methods 5:1053 (2008)). Dafür wird ein spezifischer Ligand für ein "Bait" in charakteristischen Mikrostrukuren auf einer Glasoberfläche immobilisiert. Wenn Zellen auf einem solchen Substrat wachsen, folgt das "Bait" in der Plasmamembran diesem Pattern. Die Interaktion mit einem fluoreszierenden "Prey" resultiert in einer Umverteilung des "Prey" zu gleichen Mustern, die durch totale interne Reflexions-Fluoreszenzmikroskopie detektiert werden können. Bisher wurde die Methode vorwiegend dazu verwendet, ein statisches und gemitteltes Bild einer bestimmten Interaktion zu erhalten, d.h. räumliche und zeitliche Unterschiede wurden nicht untersucht. Mit unserer Technik können diese Änderungen direkt bestimmt werden, was der Gegenstand dieses Antrags ist. Wir werden die Interaktionen zwischen dem T Zellrezeptor und einer Auswahl von möglichen Interaktionspartnern während der Ausbildung der immunologischen Synapse zwischen einer T Zelle und einer funktionalisierten Oberfläche untersuchen. Solche Nachahmungen einer Antigen-präsentierenden Zelle werden häufig verwendet und wurden auch erfolgreich in unserem Labor etabliert (Huppa et. al, Nature, in press). Unsere Idee ist nun, die Zelle mit einer mikro- oder nanostrukturierten Oberfläche in Kontakt zu bringen, die einerseits die Ausbildung von örtlichen und zeitlichen Unterschieden ermöglicht, andererseits das "Bait" in der Migration so stark retardiert, dass Interaktionen mit einem fluoreszierenden "Prey" durch die gleichzeitige Ausbildung eines Musters analysiert werden können. Um dies zu erreichen, wird es notwendig sein, das Bait-Protein reversibel mit einer einstellbaren Dissoziationskinetik an der Oberfläche zu binden. Der NTA-Ni2+-Oligohistidin Komplex wird als reversible Verknüpfung verwendet, wobei die Dissoziationskinetik durch die Verwendung von freiem Histidin auf einen Wert eingestellt wird, der für die gewünschten Effekte notwendig ist. Die Analyse von räumlichen Heterogenitäten in der Protein-Protein Interaktion verlangt nach einem Auslese- Verfahren mit einer räumlichen Frequenz, die höher ist als die gewünschte Auflösung der Muster. Für unsere etablierte Methode wurden Strukturen von 3 m verwendet, was allerdings nicht ausreicht, Details innerhalb von Strukuren der immunologischen Synapse aufzulösen. Um die Auflösung auf Werte zu erhöhen, die charakteristisch für die immunologische Synapse (1 m) sind, müssen Strukturgrößen von 250 nm und kleiner verwendet werden. Wir beantragen hier, Nanocontact Printing für diesen Zweck zu verwenden. Die Miniaturisierung wird in zwei Schritten durchgeführt werden: A) Muster werden erzeugt, die durch klassische beugungslimitierte Optiken (ca. 250 nm) abgebildet werden können. B) Muster unter 250 nm, die wir als "Nanopattern" bezeichnen, können nicht durch klassische optische Geräte abgebildet werden. Sie werden durch "Photoactivation Localization Microscopy (PALM)" ausgelesen, eine neue Technologie, die entwickelt wurde, um eine höhere Auflösung als in der Lichtmikroskopie zu erreichen, indem einzelne Fluorophore fotoaktiviert und lokalisiert werden. Die Auflösung ist dann nur limitiert durch die Lokalisierungsgenauigkeit von einzelnen Molekülen, die bei etwa 50 nm liegt.

Die spezifische Aktivierung von T Zellen beginnt im Kontaktbereich mit der Antigen- präsentierenden Zelle (APZ), der sogenannten immunologischen Synapse. Der zentrale Prozess dabei ist die Bindung des T Zell Rezeptors an Antigen, welches von MHCII Molekülen auf der Oberfläche von APZs präsentiert wird. Diese Bindung stimuliert die Rekrutierung einer Vielzahl von Signalisierungsmolekülen zur Synapse sowie deren Aktivierung. Ziel dieses Projektes war es, die zeitliche Abfolge dieses Rekrutierungsprozesses sowie die räumliche Anordnung der beteiligten Proteine zu untersuchen. Dazu verwendeten wir einerseits die von uns entwickelte Methode des Protein Micropatternings, andererseits hochauflösende einzelmolekulare Mikroskopie. Die Micropatterning Methode ermöglicht es, Proteine in der lebenden Zellmembran einzufangen und an bestimmten Stellen zu immobilisieren, indem die Zellen auf mikrostrukturierte Glasplättchen angewachsen werden. Mit dieser Methode wollten wir herausfinden, in wie fern zelluläre Proteine und Lipide einander beeinflussen. In der Tat gab es bereits seit ca. 20 Jahren Vermutungen, dass sehr kleine, dynamische Lipid-Rafts in der Zellmembran existieren; deren Nachweis war jedoch bisher experimentell nicht möglich. Mit Hilfe der Micropatterning-Technik konnten wir jedoch das Vorhandensein solcher Rafts in der lokalen Umgebung von speziellen lipidverankerten Proteinen, die als Marker von Rafts angesehen werden, ausschließen. In Folge wandten wir die Methode auf T Zellen an. Hier gelang es uns, den Zeitverlauf der Rekrutierung von Signalmolekülen genau zu bestimmen. Schließlich versuchten wir, eine weitere Miniaturisierung von Protein Mikrostrukturen auf Glasplättchen zu erzielen. Dazu wurden neue Stempelmaterialien entwickelt, womit wir im Microcontact Printing Verfahren Strukturen von weniger als 100nm Ausdehnung herstellen konnten. Damit wird es nun möglich, molekulare Rekrutierungsprozesse selbst in zellulären Strukturen zu messen, deren Ausdehnung unterhalb des Auflösungsvermögens von Lichtmikroskopie liegt. Zur Durchführung solcher Messungen war es auch notwendig, neuartige Mikroskopiemethoden zu etablieren, deren Auflösung unterhalb des Beugungslimits liegt. Wir bauten dafür Einzelmolekulare Lokalisierungsmikroskopie in unserem Labor auf. Es zeigte sich jedoch bei unseren Analysen, dass diese international mittlerweile etablierte Methode anfällig auf Abbildungs-Artefakte ist, welche sich aus der Mehrfachzählung von einzelmolekularen Signalen ergibt. So können Aggregate von Molekülen als Folge von irrtümlichen Mehrfachzählungen vorgespiegelt werden. Als solide Basis für die Interpretation unserer Messdaten entwickelten wir daher zunächst eine neue Analysemethode für solche hochaufgelösten Bilder. Weiters wandten wir diese Methode auf den T Zell Rezeptor: entgegen früheren Studien konnten wir keine Hinweise auf eine ungleiche Verteilung des Moleküls in der Zellmembran finden, was ein völlig neues Licht auf die T Zell Signalisierungsprozesse wirft.