3-D Zellträgergerüst mit Protein Nano-Ankern (3DS-PNA)

Der Schlüssel, um bei ex-vivo Experimenten an Zellen zu aussagekräftigen Ergebnissen, etwa zu deren Wachstum, zur Aktivierung, bis hin zur Differenzierung, zu gelangen, liegt in der Entwicklung möglichst definierter, aber dennoch naturnaher zellulärer Umgebungen. Insbesondere die dreidimensionale Strukturierung des Inneren von Mikrokanälen, um beispielsweise Blutgefäße zu simulieren, ist eine Herausforderung. Bisher eingesetzte Techniken, wie zum Beispiel die Dip-Pen Nano-Lithographie, die Nanoimprint-Lithographie oder die Elektronenstrahllithographie, sind allesamt auf eine zweidimensionale Strukturierung beschränkt. Bei hohen Aspektverhältnissen spricht man bestenfalls von "2,5 facher" Dimensionalität. Die einzige dreidimensionale Technik, die wohldefinierte und auch nicht-periodische Strukturen mit einer Auflösung im Mikrometerbereich erlaubt, ist die Zweiphotonenlithographie (two photon polymerization lithography, 2PPL). Diese ist gut geeignet, um Strukturen zur Anheftung von Zellen zu erzeugen. Allerdings können derzeit keine funktionalen Ankerpunkte im Nanometerbereich hergestellt werden. Nanoskopische Ankerpunkte wären aber interessant, um zum Beispiel feinste Störungen von Gefäßwänden zu simulieren oder als Präsentationspunkte für einzelne Proteine wie Antikörper oder Aktivierungsfaktoren zu dienen. In der Gruppe des Antragstellers T. Klar hat sich jüngst eine Erweiterung der 2PPL etabliert, die Stimulated Emission Depletion (STED) Lithographie, mit der nanoskopische Strukturgrößen in drei Dimensionen erreicht werden können. Die STED Lithographie ist verwandt mit der STED Mikroskopie, die vom Antragsteller mit entwickelt wurde und, die Auflösungen weit unterhalb des Abbe-Limits erlaubt. Es ist das Ziel dieses Projektes, mit STED-2PPL nanoskopische Andockstellen (NanoAnchors) für Antigene, Antikörper oder Aktivierungsfaktoren auf die mit klassischer 2PPL hergestellten mikroskopischen Gerüste (3D Scaffolds) "aufzusetzen". Als Demonstrationsbeispiel sollen derartige "3D Scaffolds carrying Protein NanoAnchors" (3DS-PNA) angewendet werden, um Fragen der Thrombozytenaktivierung nach Verletzungen der Blutgefäße, bei Präsentation bestimmter Proteine wie Aktivierungsfaktoren oder auch bei verschiedenen Flussparametern zu untersuchen. Das Projektkonsortium, bestehend aus dem Institut für Angewandte Physik der JKU Linz (eines von fünf Instituten weltweit, in dem derzeit die STED-Lithographie beherrscht wird) und der Blutzentrale Linz (forschendes Institut des Roten Kreuzes), deckt alle notwendigen Bereiche ab, um das Projekt erfolgreich durchzuführen. Weitere Synergien ergeben sich durch nationale und internationale Kooperationspartner, wie z. B. Prof. Stefan Hell, (MPI Göttingen, Deutschland), Dr. Lrnd Kelemen (Univ. Szeget, Ungarn), Prof. Peter Bettelheim (Krankenhaus der Elisabethinen, Linz) und Dr. Heinz Redl (Ludwig Boltzmann Institut für Traumatologie, Linz). Diese Gruppen könnten eine 3DS-PNA Plattform in ihrer jeweiligen biophysikalischen oder medizinischen Forschung sehr gewinnbringend einsetzen.

Der Schlüssel, um bei ex-vivo Experimenten an Zellen zu aussagekräftigen Ergebnissen, etwa zu deren Wachstum, zur Aktivierung, bis hin zur Differenzierung, zu gelangen, liegt in der Entwicklung möglichst definierter, aber dennoch naturnaher zellulärer Umgebungen. Insbesondere die dreidimensionale Strukturierung des Inneren von Mikrokanälen, um beispielsweise Blutgefäße zu simulieren, ist eine Herausforderung. In diesem Projekt ist es uns gelungen, derartige Strukturen in Flusszellen zu schreiben und an vordefinierten Punkten im dreidimensionalen Raum den von-Willebrand-Blutgerinnungsfaktor zu fixieren. Damit können nun realitätsnahe Studien zur Aktivierung von Blutplättchen und einer daraus resultierenden Bildung eines Blutgerinnsels in Abhängigkeit wichtiger Parameter studiert werden. Diese Parameter sind, unter anderen: die Dichte der von-Willebrand-Faktoren auf der Mikrometer Skala (Größe eines Blutplättchens), die Dichte auf der Skala weniger 10 Nanometer (Größe eines Adhäsionspunktes eines Blutplättchens), die Flussgeschwindigkeit etc. Technologisch wurde damit ein wesentlicher Fortschritt erzielt, da bisher eingesetzte Techniken zur Nanostrukturierung, wie zum Beispiel die Dip-Pen Nano-Lithographie, die Nanoimprint-Lithographie oder die Elektronenstrahllithographie, allesamt auf eine zweidimensionale Strukturierung beschränkt sind. Möglich wurde dies durch die Erweiterung der Zweiphotonenlithographie hin zur Stimulated Emission Depletion (STED) Lithographie, mit der nanoskopische Strukturgrößen in drei Dimensionen erreicht werden können. Die STED Lithographie ist verwandt mit der STED Mikroskopie, die von T. Klar mit entwickelt worden ist, und welche Auflösungen weit unterhalb des Abbe-Limits erlaubt. Neben der Realisierung der dreidimensionalen Strukturen war es ein weiteres Anliegen, diverse Methoden zu untersuchen, die eine möglichst gute Adhäsion von Proteinen, Antigenen, Antikörpern oder Aktivierungsfaktoren erlauben, im Idealfall durch die gezielte, nanolokalisierte Ausbildung von Kovalenten Bindungen. Dies wurde durch mehrere Strategien erreicht. Als weiteres Anwendungsbeispiel wurde ein dreidimensionaler Immunoassay gezeigt, in dem, unter anderem, die für den Cholesterolhaushalt wichtigen Partikel mit Lipoproteinen hoher Dichte untersucht werden können. Die Ergebnisse wurden in 4 wissenschaftlichen Publikationen in angesehenen Journalen veröffentlicht (eine weitere ist eingereicht, eine in Vorbereitung) und in mehr als 20 Vorträgen und Posterpräsentationen auf nationalen und internationalen Konferenzen vorgestellt.