Nichthäm-Fe(II)-Hydroxylasen: von Struktur-Funktionsbeziehungen zum Redesign

Selektive Oxidationen von nichtaktivierten Kohlenstoffen mittels O2 sind synthesechemisch immer noch eine große Herausforderung. Im Gegensatz dazu gibt es in der Natur Strategien, um die hochselektive Oxidation organischer Moleküle zu ermöglichen. P450-Häm- und die Nichthäm-Fe(II)-Zentren sind wohl die vielfältigsten unter den O2 abhängigen Syntheseenzymen. Im Gegensatz zu den P450-Enzymen werden die Nichthäm-Fe(II)-Proteine nicht als Plattform verwendet um maßgeschneiderte` Oxidationen zu designen, und das obwohl sie ein einzigartiges katalytisches Potential besitzen. Gründe dafür sind unter anderem die Instabilität der Enzyme ausserhalb der Zelle und die oft problematische Etablierung von Ganzzellscreeningmethoden für diese Umsetzungen. Diese Faktoren schränken die Anwendbarkeit von evolutionsbasierten Enzymdesigntechniken ein. Rationale Methoden des Enzymdesign, die auf einem fundamentalen Verständnis der Beziehung zwischen Enzymstruktur und Funktion beruhen könnten helfen diese Kluft zu überbrücken. a-KG abhängige Nichthäm-Fe(II)-hydroxylasen (a-KG-MNH ) sind Nichthäm-Fe(II)-Enzyme, die eine Reihe von Zellmetaboliten oxidativ hydroxylieren. Sie haben einen Cupin-Fold und zeigen alle ein gleich strukturiertes Metallzentrum. Trotzdem haben die einzelnen a-KG-MNHs hohe, sich deutlich unterscheidende Regio-, Stereo- und Substratselektivitäten. In diesem Projekt wird die strukturelle Basis dieser Diversität untersucht. Hierfür werden einzelne a-KG-MNH-Vertreter aus der Gruppe mittels exsperimentellen und computergestützten Methoden charakterisiert. Mutationsanalyse und kinetische und spektroskopische Methoden werden mit molekulardynamischen Studien korreliert, um Einblicke in den Einfluss von Protein- und Metallzentrenstruktur auf einzelne katalytische Schritte zu erhalten. Das Ziel der Studie ist es, neue katalytische Funktionen in die a-KG- MNH-Strukturen einzubauen. Im Zuge dessen wird auch untersucht, inwieweit sich molekulardynamische Studien eignen, um katalytische Eigenschaften computergestützt und mittels quantifizierbarer Deskriptoren zu rationalisieren und vorherzusagen. Weiters werden die Resultate aus der Studie mit Literatur-, Struktur- und Sequenzdaten korreliert, um die strukturellen Motive zu definieren, die für die Stereo-, Regio- und Substratselektivitäten verantwortlich zeichnen. Das Verständnis bezüglich des Zusammenspiels zwischen Proteinstruktur und katalytischen Eigenschaften in a-KG-MNHs soll auf diese Weise vertieft werden, um ihr computergestütztes Redesign zu ermöglichen um damit ihr katalytisches Repertoir zu erweitern. Dies könnte wiederum neue biosynthethische Routen eröffnen um nachhaltig Feinchemikalien aus erneuerbaren Rohstoffen zu produzieren.

Ziel dieses Projektes war es, auf molekularer Ebene zu charakterisieren, wie nicht- Hämeisen(II)-haltige Proteine organische Moleküle in kontrollierter, selektiver Weise verbrennen können. Dieses Wissen dient als Grundlage, um Werkzeuge zu entwickeln, mit welchen neue, maßgeschneiderte Reaktionen designed werden können. Das Verbrennen von organischer Materie ist uns generell als chaotischer Prozess bekannt, der CO2 und Asche erzeugt. Sogar für synthetische Chemiker gilt die kontrollierte Oxidation von organischen Substanzen mittels molekularem Sauerstoff (O2) generell als kaum beherrschbar. Im Gegensatz dazu hat die Natur Systeme entwickelt, die O 2 durchaus für die kontrollierte Synthese von Molekülen nutzen können: Nichthäm-Eisen(II)-Oxygenasen (NHIOs) sind Proteine, die Meister darin sind, organische Moleküle smart zu verbrennen, indem sie molekularen Sauerstoff sehr selektiv in ihre Target-Moleküle einfügen, Reaktionen, für die die Evolution sie maßgeschneidert hat. Die Natur hat dies erreicht, indem sie ein Eisen(II)-Zentrum, welches O2 aktiviert, mit einer Proteinstruktur ummantelt hat, welche das Target-Molekül auf eine Weise leitet und positioniert, dass das aktivierte Sauerstoffatom sehr selektiv an der Zielposition im Molekül angreifen und dann dort inkorporiert werden kann. Die genauen Mechanismen mit denen die Proteinstrukturen die jeweiligen Zielmoleküle leiten sind oft noch unklar. Ziel des Projektes war daher aufzuklären, wie Proteinstrukturen diesen selektiven Prozess steuern. Um dies zu tun, wurden ausgewählten Proteinstrukturen und deren Interaktionen mit organischen Zielmolekülen am Computer untersucht, und die strukturellen Faktoren, die für die Hinleitung der jeweiligen Oxygenierungs-Zielpositionen des Moleküls zum Eisenzentrum verantwortlich sind wurden identifiziert. Daraufhin wurden diese strukturellen Faktoren in vitro geändert (Mutationsanalyse), und die Auswirkungen dieser strukturellen Änderungen auf die katalytische Reaktion wurden charakterisiert. Der Prozess am Computer wurde so iterativ validiert und optimiert und resultierte in einer automatisierten Computerplattform, die im Prinzip die Vorhersage von strukturellen Änderungen auf die Katalyse und in Folge das Redesign von Enzymen mit veränderten Sauerstoffinsertionsmustern erleichtert. Parallel dazu wurde ein System zum Hochdurchsatz-Screening von NHIOs etabliert. Das resultierende System wurde verwendet, um NHIOs zu designen, die enantionmerenreine (R)-Mandelsäure erzeugen (bekannte natürliche Enzyme produzieren nur das spiegelbildliche Molekül (S)-Mandelsäure) sowie um NHIOs mit veränderten Aminosäurehydroxylierungsmustern zu engineeren. Zusammenfassend hat das Projekt eine Plattform geschaffen, die das Design von Biokatalysatoren erleichtert, welche neue Routen für die nachhaltige, fermentative Synthese von pharmazeutischen Bausteinen eröffnen.