NMR-Charakterisierung katalytisch-aktiver Konformationen des Hammerhed Ribozyms

Im Fokus des hier vorgestellten Forschungsprojektes steht eine NMR spektroskopische Untersuchung des natürlich vorkommenden Hammerhead Ribozyms. Zu diesem Zweck wird ein vor kurzem von uns entwickeltes 13C- Isotopenmarkierungsprotkoll für RNA verwendet. Damit kann funktionelle Dynamik im Mikro- bis Millisekundenbereich qunatitativ analysiert werden. Mit Hilfe von sogenannten Relaxationsdispersions-Messungen an der Wildytp-Sequenz des Hammerhead Riboyzms, aber auch an Mutanten (Nucleotidmutationen und funktionelle Gruppen-Mutationen), soll ein genaues Bild dieser für die Katalsye wichtigen Dynamik entstehen. Im Mittelpunkt des hier vorgestellten NMR spektroskopischen Forschungsprojekt steht eine umfassende Analyse der strukturellen Dynamik, die eine zentrale Rolle im katalytischen Prozess des Ribozyms spielt.

Die ursprünglich geplanten Ziele die Visualisierung der funktionell wichtigen Zustände des Hammerhead-Ribozyms konnten leider nicht umgesetzt werden, da trotz Optimierungsversuchen kein Konstrukt gefunden werden konnte, welches Kernresonanz (NMR) Spektren mit ausreichender hoher Qualität ergab. Deshalb wurden die ursprünglichen Ziele auf eine vor kurzem entdeckte katalytische RNA dem Pistol-Ribozym übertragen. In Rahmen des Projekts konnte ein Konstrukt erarbeitet werden, welches NMR Spektren mit hoher Qualität zeigt. Dieser funktionelle Komplex wurde von uns im Rahmen von Kooperationen mittels biophysikalischen Methoden, wie Röntgenkristallographie oder NMR Spektroskopie, untersucht und es konnte ein Vorschlag für den Mechanismus der Selbstschneide-Reaktion postuliert werden. Dieser Mechanismus wird im Moment mit Hilfe der ursprünglich geplanten Kernresonanz-Experimente verfeinert. Die soweit erhaltenen und hoffentlich bald zusätzlichen Daten geben ein genaues Bild der von dieser RNA katalysierten Reaktion und wird die Applikation des Ribozyms in der Biotechnologie ermöglichen. Zusätzlich, da dieses Ribozym, möglicherweise in pathogenen Bakterien zur Genregulation dient, planen wir in Zukunft kleine Moleküle zu designen, die spezifisch den Reaktions- relevanten Übergangszustand erkennen und blockieren. Dies würde den Zugang zu neuen auf RNA-abzielende Medikament-Verbindungen geben.