Signalwahrnehmung und Signalweiterleitung durch die kleinen RNAs GlmY und GlmZ

Kleine regulatorische RNAs (sRNAs) sind eine etablierte Klasse von Genregulatoren, die in Bakterien zahlreiche physiologische Prozesse kontrollieren. Wie jedoch sRNAs iherseits kontrolliert werden, ist noch wenig verstanden. Die GlmY/GlmZ sRNA Kaskade in Escherichia coli ist ein Beispiel für einen komplexen sRNA-Regelkreis mit vielen Input-Funktionen. GlmY und GlmZ sind homologe sRNAs, die gemeinsam die Syntheserate des Enzyms Glukosamin-6-Phosphat (GlcN6P) Synthase GlmS an die Konzentration dessen Produkts GlcN6P anpassen. Von beiden sRNAs kann nur GlmZ mit einer inhibitorischen Stamm-Schlaufenstruktur basenpaaren, welche die Ribosomonebindestelle in der glmS mRNA maskiert,. Diese Basenpaarung aktiviert die Synthese von GlmS, welches die Bildung von GlcN6P katalysiert, das ein essentielles Vorläufermolekül der Zellwandbiosynthese ist. GlmZ unterliegt jedoch einer Prozessierung durch RNase E, wodurch die basenpaarenden Nukleotide entfernt und der Abbau von GlmZ eingeleitet wird. Unsere jüngst erhaltenen Daten zeigen, dass GlmZ per se kein Substrat der RNase E ist und dass dessen Prozessierung in vivo und in vitro das Protein RapZ benötigt. Es zeigte sich, dass RapZ einen neuen Typ von sRNA-Bindeproteinen repräsentiert, welches GlmZ bindet und zu dessen Prozessierung durch RNase E rekrutiert. Dieser Prozess schliesst die Interaktion von RapZ mit RNase E ein. Die zweite sRNA GlmY, die bei GlcN6P-Mangel akkumuliert, aktiviert die Expression von glmS durch einen indirekten Mechanismus. GlmY ist eine Köder RNA und sequestriert RapZ, wodurch die Prozessierung von GlmZ unterbunden wird. Somit wirkt RapZ als Adapter und GlmY als Antiadapter beim regulierten Abbau der basenpaarenden sRNA GlmZ. Dieser neuartige Mechanismus erklärt, wie Spezifität beim regulierten Abbau einer sRNA erreicht werden kann. Wichtige Fragen bezüglich des GlmY/GlmZ/RapZ-Regelkreises bleiben ungeklärt und sollen in dem vorgeschlagenen Projekt untersucht werden. Zunächst soll der Mechanismus des durch RapZ kontrollierten Abbaus von GlmZ aufgeklärt werden. Es ist denkbar, dass RapZ ein allosterischer Aktivator der RNase E ist. Alternativ könnte RapZ Strukuränderungen in GlmZ bewirken, wodurch GlmZ von RNase E als Substrat erkannt wird. Zweitens, soll geklärt werden, wie GlcN6P durch die GlmY/GlmZ-Kaskade wahrgenommen wird. Unsere Vorarbeiten lassen vermuten, dass GlmY GlcN6P direkt bindet und hierdurch in seiner Aktivität reguliert wird. Dies eröffnet die faszinierende Möglichkeit, dass GlmY das erste Beispiel einer Metaboliten-bindenden autonom kodierten sRNA darstellt. Zusammen genommen ist zu erwarten, dass das vorgeschlagene Projekt Einsichten liefert, wie beim Abbau eines RNA-Substrats durch eine global wirksame RNase Spezifität erreicht werden kann, und wie ein spezifisches Signal durch eine sRNA auf der post-transkriptionellen Ebene wahrgenommen wird.

E. coli und verwandte Bakterien besitzen eine aus Peptidoglykan und zwei Membranen bestehende Zellhülle, welche Schutz gegen Umwelteinflüsse bietet. Der erste und gleichzeitig limitierende Schritt bei der Zellhüllbiosynthese ist die Synthese von Glukosamin- 6-Phosphat (GlcN6P) durch das Enzym GlmS. Um eine kontinuierliche Zellhüllbiosynthese zu gewährleisten, muss stets genügend GlcN6P zur Verfügung stehen. Dies wird durch einen post-transkriptionellen Regelkreis bewirkt, an welchem die kleinen RNAs (sRNAs) GlmY und GlmZ, sowie das RNA-bindende Protein RapZ beteiligt sind. GlmZ aktiviert die glmS Translation durch Basenpaarung. Bei ausreichendem GlcN6P-Spiegel, wird GlmZ durch RapZ gebunden und durch Rekrutierung der RNase E prozessiert und abgebaut. Bei GlcN6P-Mangel akkumuliert die homologe sRNA GlmY, welche als Köder dient und RapZ sequestriert, wodurch der Abbau von GlmZ unterbleibt. Es wurden zunächst die molekularen Eigenschaften charakterisiert, die den unterschiedlichen Funktionen der beiden homologen sRNAs zu Grunde liegen. Diese Arbeiten führten zur Entdeckung eines RNA-Aptamers, welches als Werkzeug eingesetzt werden kann, um beliebige RNAs in 5-monophosphorylierter Form in vivo zu erzeugen, was interessante Anwendungen bereithält. Die Bestimmung der Kristallstruktur von RapZ enthüllte einen neuen Typ von RNA-bindenden Proteinen, welcher in der Evolution wahrscheinlich aus einem glykolytischen Enzym entstand. Die aktive Form von RapZ ist ein Tetramer, welches innerhalb eines möglichen Sandwich-Komplexes die ebenfalls tetramere RNase E allosterisch aktiviert, um das im Sandwich eingeschlossene GlmZ-Molekül zu prozessieren. Weiterhin repräsentiert RapZ den gesuchten GlcN6P Sensor: RapZ bindet GlcN6P mit hoher Affinität und rapZ-Mutanten sind blind für dieses Metabolit. Durch Interaktion mit einem Transkriptionsfaktor stimuliert RapZ bei GlcN6P-Mangel die Expression von GlmY. Abhängig vom GlcN6P-Spiegel kontrolliert also RapZ die Produktion seiner eigenen Köder-RNA GlmY, welche sodann RapZ in stabilen Ribonukleinkomplexen sequestriert und somit den Abbau von GlmZ verhindert. In einem weiteren Projektteil wurde untersucht ob das System für antimikrobielle Chemotherapie ausgenützt werden kann. Antibiotika sind bekannt, die durch Hemmung von GlmS wirken, aber wegen ihrer limitierten Wirksamkeit nicht gegen Gram-negative Bakterien eingesetzt werden. Wir zeigen, dass diese intrinsische Resistenz auf dem GlmY/RapZ/GlmZ System beruht, welches eine Hemmung von GlmS durch dessen Überexpression kompensiert. Daher stellen Inhibitoren dieser Kaskade wie z.B. nicht-metabolisierbare GlcN6P-Analoga attraktive Adjuvantien dar, die die Wirksamkeit der gegen GlmS gerichteten Antibiotika erheblich potenzieren können.