Funktionelle Charakterisierung von RNA Ligasen in Escherichia coli

Kürzlich konnten wir einen völlig neuartigen Mechanismus der post-transkriptionellen Stressantwort in Escherichia coli identifizieren. Er basiert auf einer funktionellen Spezialisierung der Ribosomen durch die Aktivität der stressinduzierten Endoribonuclease MazF, der Toxin-Komponente des Toxin- Antitoxinsystems mazEF. MazF entfernt durch seine spezifische RNase-Aktivität eine kurze Region am 3-Ende der 16S rRNA in der auch die essentielle anti-Shine und Dalgarno (aSD) Sequenz lokalisiert ist. Da die Interaktion zwischen der aSD Sequenz und der Shine und Dalgarno (SD) Sequenz vor dem AUG Startkodon notwendig für die Initiation der Proteinsynthese ist, können diese modifizierten Ribosomen nur sogenannte leaderless mRNAs translatieren, die direkt mit dem Startkodon beginnen und keine SD Sequenz aufweisen. Da unter Stressbedingungen MazF auch bestimmte Transkripte direkt vor dem Startkodon schneidet und diese somit leaderless werden, kommt es zu einer Modulation und Anpassung des translationalen Programms an die gegebenen Bedingungen. Zusammengefasst werfen diese Ergebnisse die fundamentale Frage nach dem Schicksal der spezialisierten Ribosomen währen der Regeneration nach Stress auf, d.h. unter Bedingungen, die die Translation von kanonischen Transkripten mit SD Sequenz erfordern. Unter Berücksichtigung der Komplexität des translationalen Apparates und der großen Menge an Energie, die benötigt wird um Ribosomen herzustellen, liegt die Hypothese nahe, dass es einen Reparaturmechanismus für diese Ribosomen gibt. Ein solcher Mechanismus würde es der Zelle ermöglichen, die volle Funktionalität der spezialisierten Ribosomen ohne hohen Energieaufwand wieder herzustellen. Daher ist das Ziel dieses Projektes, die molekularen Mechanismen der Regeneration von Ribosomen näher zu charakterisieren. Unsere vorausgehenden Studien deuten darauf hin, dass das durch MazF entfernte RNA-Fragment durch eine RNA-Ligase wieder an die verkürzte 16S rRNA angehängt werden kann. Daher ist ein weiterer Schwerpunkt dieser Studie die funktionelle Charakterisierung der zwei in Escherichia coli annotierten RNA-Ligasen, LigT und RtcB, deren physiologische Aufgabe noch unbekannt ist. Es ist zu erwarten, dass die Ergebnisse dieser Studie Einblick in einen bisher völlig unbekannten Mechanismus, nämlich der reversiblen Modulation der Ribosomenspezifität, geben, wodurch das Ribosom funktionell von einem reinen Syntheseapparat zu einem Schlüsselfaktor in der Translationsregulation aufgewertet wird. Zusätzlich könnten die beteiligten Faktoren auch potentielle Angriffspunkte für neue antimikrobielle Stoffe darstellen, die das Wiederaufkeimen von persistenten Infektionen verhindern könnten, da sie auch essentiell für das Überleben von pathogenen Bakterien nach der Infektion ihres Wirtes sind.

Bakterien müssen ständig auf veränderte Lebensbedingungen reagieren. Vor allem pathogene Bakterien erfahren nach der Infektion ihres Wirtes z.B. oxidativen Stress und Nährstoffmangel. Um diese "unwirtlichen" Bedingungen überleben zu können, haben sie Strategien entwickelt um auf diese Veränderungen zu reagieren. In unseren vorangegangenen Studien konnten wir einen neuen Mechanismus in der bakteriellen Stressantwort beschreiben: Die stressaktivierte Endoribonuklease MazF schneidet Ribonukleinsäuren (RNA) an bestimmten Sequenzmotiven. Dies führt einerseits zum Abbau des Großteils der Boten-RNA (mRNA), andererseits werden einige Transkripte dadurch in ihren 5'-nicht-translatierten Bereichen prozessiert. Im Weiteren kann MazF die ribosomale RNA an einer bestimmten Stelle schneiden und somit die Selektivität der Ribosomen, der Proteinsynthesefabriken, verändern. Zusammengefasst, kommt es unter Stress zu einer raschen und energiesparenden Umprogrammierung der Proteinsynthese. Da diese modifizierten Ribosomen aber nur prozessierte mRNAs translatieren, werfen diese Ergebnisse die fundamentale Frage nach dem Schicksal der spezialisierten Ribosomen währen der Regeneration nach Stress auf, d.h. unter Bedingungen, die die Translation von kanonischen Transkripten erfordern. Unter Berücksichtigung der Komplexität des translationalen Apparates und der großen Energiemenge, die benötigt wird um Ribosomen herzustellen, liegt die Hypothese nahe, dass es einen Reparaturmechanismus für diese Ribosomen gibt. Im Rahmen dieses Projektes konnten wir zeigen, dass diese veränderten Ribosomen durch die Aktivität einer RNA-Ligase wieder regeneriert werden können und somit ihre volle Translationsaktivität wiederhergestellt wird. Weiters haben wir die physiologischen Aufgaben der RNA-Ligase in E. coli näher charakterisiert. Durch unsere Studien konnten wir einen bisher völlig unbekannten Mechanismus, nämlich die reversible Modulation der Ribosomenspezifität, beschreiben, der das Ribosom funktionell von einem reinen Syntheseapparat zu einem Schlüsselfaktor in der Translationsregulation aufwertet.