Einfluss der Proteinfaltung auf Allergenität und Immunogenität

Im letzten Jahrzehnt gab es in der Immunforschung große Fortschritte bei der Untersuchung des Zusammenspiels zwischen dem angeborenen und dem erworbenen Immunsystem. Insbesondere die Mechanismen zur Erkennung von Pathogenen und die daraus resultierende Förderung von T-Helfer 1/T-Helfer 17 Immunantworten wurden im Detail untersucht. Sehr viel weniger ist bekannt über die Mechanismen, die der Aktivierung von regulatorischen T Zellen zu Grunde liegen und sogar noch weniger über T-Helfer 2 Zellen, die eine zentrale Rolle bei allergischen Immunreaktionen spielen. T- Helfer 2 Polarisierung findet auf unterschiedlichen Ebenen statt. Zellen und Rezeptoren des angeborenen Immunsystems spielen dabei eine wichtige Rolle, wobei dendritische Zellen entweder T-Helfer 2 Signale aus den Geweben erhalten oder selbst als Sensoren fungieren. Grundsätzlich scheint T-Helfer 2 Polarisierung genauso komplex zu sein wie die Initiierung von T-Helfer 1, T-Helfer 17, oder von regulatorischen Immunantworten und die Allergenizität der unterschiedlichen Allergene kann nicht an einer einzelnen Eigenschaft festgemacht werden. In aktuellen Publikationen konnte gezeigt werden, dass zur T-Helfer 2 Polarisierung auch Charakteristika der Proteine selbst, wie Protease-Aktivität, Nachahmung von Rezeptor/Ligand Interaktionen, oder die Bildung von Dimeren beitragen können. Außerdem gibt es mehr und mehr Daten, die für eine mögliche Rolle der Stabilität von Proteinen für ihre Immunogenität und den von ihnen induzierten Typus der Immunantwort sprechen. Dieses Projekt konzentriert sich auf den letztgenannten Aspekt. Basierend auf bereits bekannten Kristallstrukturen können Moleküle mit Hilfe von in silico Berechnungen und durch Simulation der Molekulardynamik identifiziert werden, die im Vergleich mit dem Wildtyp-Protein eine durch Einführung von Punktmutationen reduzierte oder gesteigerte Stabilität aufweisen. Ausgewählte Moleküle aus beiden Kategorien werden rekombinant hergestellt, biochemisch und biophysikalisch charakterisiert, und ihre Aufnahme und Degradation durch dendritische Zellen analysiert. Letzteres umfasst auch die Untersuchung der Peptide, die auf MHC-II Molekülen präsentiert werden. Zusätzlich werden mittels Röntgendiffraktometrie und Kernspinresonanzspektroskopie die in silico gewonnenen Daten mit empirischen Strukturdaten korreliert. Die Varianten mit unterschiedlicher Stabilität werden in vivo in Mausmodellen getestet, wobei ohne Verwendung von Adjuvanzien sensibilisiert wird, um den natürlichen Weg der Allergenaufnahme nachzuahmen. Mittels Analyse der Antikörper Subklassen, der T Zell Proliferation, der Zytokinprofile, und der Identifizierung der dominanten T Zell Epitope wird der Einfluss der Proteinstabilität auf die Immunogenität, Allergenizität und Immunpolarisierung untersucht. Das Projekt konzentriert sich auf die beiden klinisch relevanten Pollenallergene Bet v 1 und Phlp 6. Zusätzlich werden Lysozym und Ovalbumin aus Hühnereiweiß als Modellantigene verwendet, die beide immunologisch sehr gut charakterisiert sind. Transgene Mausmodelle mit T Zellen spezifisch für diese beiden Proteine ermöglichen die Untersuchung der frühen Schritte in der Aktivierung von T Zellen und in der Polarisierung von Immunantworten. Die zu erwartenden Resultate des Projektes werden ein umfassendes Bild darüber liefern, wie sich die Stabilität von Proteinen auf entscheidende Schritte im Verlauf einer Immunantwort und auf die allergische Sensibilisierung auswirkt.

Warum einige ubiquitär vorkommende Proteine als Allergene wirken, während der Großteil der Proteine aus denselben Quellen nicht das Potenzial zur allergischen Sensibilisierung besitzt, ist bisher nicht geklärt. Wir wollten in unserem Projekt herausfinden, ob die Faltungsstabilität von Proteinen zu ihrer Allergenizität beiträgt. Zu diesem Zweck haben wir einen Algorithmus verwendet, der es ermöglicht, die Auswirkung einer Punktmutation innerhalb einer Proteinsequenz auf die Stabilität des Proteins vorherzusagen. Ausgewählte Kandidatenmoleküle mit erhöhter oder verringerter Strukturstabilität wurden rekombinant hergestellt und im Detail charakterisiert. Wir analysierten die Proteine anschließend in vitro bezüglich Eigenschaften wie Resistenz gegenüber Proteasen, ihrer Prozessierung, der dabei generierten Epitope und ihres Potenzials, T-Zellen zu aktivieren und zu polarisieren. Schließlich wurden die neu generierten Moleküle durch Immunisierung von Mäusen hinsichtlich ihrer Immunogenität und Allergenizität untersucht. Vor etwa 10 Jahren entstand das Paradigma, dass durch Erhöhung der Stabilität eines Proteins auch dessen Immunogenität hinsichtlich der Produktion von Antikörpern gesteigert wird, allerdings nur bis zu einem bestimmten Grenzwert. Oberhalb dieser Stabilitätsgrenze sollte demnach die Immunogenität wiederum sinken. Wir konnten im Gegensatz dazu zeigen, dass auch Proteine mit einer Stabilität weit über diesem Grenzwert hoch immunogen sein können und dass dafür nicht alleine die thermodynamische Stabilität eines Proteins, sondern vielmehr seine pH Stabilität während der Passage durch das Endolysosom ausschlaggebend ist. Wir postulieren daher, dass ein Protein stabil genug sein muss, um im frühen Endosom zu überleben, aber im späten Endosom entfaltet vorliegen muss, um für den Verdau durch Proteasen zugänglich zu werden und so eine effiziente Prozessierung von Peptiden für die MHC-II Präsentation zu ermöglichen. Bisher wurden die Peptide, die tatsächlich von Antigen-präsentierenden Zellen präsentiert werden, durch Ablösen von den MHC-II Molekülen von in vitro generierten dendritischen Zellen und anschließender Massenspektroskopie identifiziert. Auf diese Weise entdeckten wir jedoch nur endogene Peptide der dendritischen Zellen, aber keine Peptide der exogen zugeführten Proteine. Da dies auf ein Sensitivitätsproblem der Methode hinweist, generierten wir als Alternative T Zell-Hybridome spezifisch für immundominante Peptide, die auf Interaktion mit ihrem Peptid-MHC-II Komplex mit der Produktion von Interleukin-2 reagieren. Durch Verwendung dieser Methode konnten wir erstmals zeigen, dass in Abhängigkeit von der Faltungsstabilität des umgebenden Proteins Peptide mit stark unterschiedlicher Effizienz prozessiert und präsentiert werden können. Außerdem konnten wir zeigen, dass eine Veränderung der Stabilität eines Proteins durch eine einzelne Punktmutation in der Proteinsequenz die T-Zell Polarisierung stark verändern kann. Die Ergebnisse unsere Studie sind nicht nur für die Entwicklung maßgeschneiderter Therapien gegen allergische Erkrankungen, sondern für das Design verbesserter Vakzine im Allgemeinen von Bedeutung.