Funktionelle Analyse einer Arabidopsis AAA+ ATPase in Synzytien

Eine TranskriptomAnalysevon Synzytiendie von dem Zuckerrüben Zystennematoden Heterodera schachtii in Arabidopsis Wurzeln induziert werden, ergab, daß ein Gen (At1g64110), welches für eine AAA+ ATPase kodiert, in Synzytien stark induziert wird. Dieses Gen gehört zu einer kleinen Genfamilie von 3 Genen in Arabidopsis. Unsere bisherigen Arbeiten haben gezeigt, daß dieses Gen wichtig für die Synzytien Entwicklung und für die Reaktion auf abiotischen Stress ist. In diesem Project wollen wir dieses Gen näher untersuchen. Antikörper und transgene Linien mit GFP bzw. FLAG markierten ATPasen werden eingesetzt, um die Verteilung dieser AAA+ ATPase in der Zelle zu studieren. Ein wichtiger Teil dieses Projektes wird sich mit der möglichen Funktion dieser Proteine beschäftigen, worüber bis jetzt nichts bekannt ist. Für die Funktionsanalyse sollen T-DNA Mutanten und Überexpressionslinien verwendet werden. Verwandte AAA+ ATPasen sind in Pflanzen weit verbreitet und ähnliche Proteine finden sich auch in Hefe. In einem weiteren Ansatz sollen deshaln Hefemutanten für AAA+ ATPasen in einer Komplementationsanalyse verwendet werden. Dies sollte auch weitere Hinweise auf die Rolle dieser Gene für die Entwicklung von Synzytien geben.

Das Gen At1g64110 aus Arabidopsis thaliana stammt aus einer kleinen Gruppe von Genen die für AAA+ATPasen codieren zu denen auch At5g52882 und At4g28000 zählen. Es wurde gezeigt, dass At1g64110 in Synzytien, ein vom Zysten Nematoden Heterodera schachtii induziertes Nährgewebe in den Wurzeln, stark überexprimiert wird. Die Bedeutung dieses Gens für die Entwicklung von Synzytien wurde anhand von künstlicher miRNA und T-DNA Mutanten gezeigt. Bis dato ist die Funktion dieser ATPasen jedoch unbekannt, daran änderte auch eine Komplementierung von Hefemutanten für verschiedenste AAA+ATPasen nichts. Deshalb wurden in dieser Arbeit 2 Fragmente der At1g64110 AAA+ATPase als Fusionsproteine in Escherichia coli exprimiert. Nach der Aufreinigung mittels HPLC konnten diese Antigene für die Erzeugung von spezifischen Antikörpern genutz werden. Neben den ATPase spezifischen Antikörpern wurden auch Anti-FLAG und Anti-GFP Antikörper genutzt da die entsprechenden Epitope gentechnisch an die ATPase gehängt wurden um sie zunächst in Nicotiana benthamiana zu exprimieren und mittels Konfokal Laser Scanning Mikroskopie und Western Blot nachzuweisen. Die selben Konstrukte wurden dann zur stabilen Überexpression in A. thaliana genutzt. Neben der Überexpression wurden auch Tripelmutanten für alle 3 ATPasen sowie Promoter::GUS Linien für At5g52882 und At4g28000 hergestellt. Die Mutanten wurden Nematodeninfektionstests zur quantitativen Analyse unterzogen. Die Promoter::GUS Linien wurden ebenfalls infiziert um die Expression dieser Gene in den Synzytien zu untersuchen. Darüber hinaus wurde versucht die At1g64110 AAA+ATPase aus verschiedenen Proteinextrakten mittels Immunoprezipitation über die spezifischen Antikörper aufzureinigen und anschließend mittels Western Blot und Massenspektrometrie nachzuweisen.