Domäneninteraktion zur Kontrolle der STIM1 Aktivierung von Orai1 Kanälen

Speicher abhängiger Ca2+ Einstrom ist essentiell für die Anschaltung und Aufrechterhaltung einer effektiven Immunantwort. Ca2+ Einstrom erfolgt über sogenannte CRAC Kanäle in der Plasmamembran, welche durch das Zusammenspiel von STIM1 und Orai1 geöffnet werden. Diese Aktivierungskaskade wird durch STIM1 initiiert, welches im endoplasmatischen Retikulum lokalisiert ist und mittels seiner zytosolischen Domänen (CAD/SOAR) direkt an den Ionenkanal Orai1 in der Plasmamembran bindet und diesen in weiterer Folge aktiviert. Diese im Ruhezustand der Zelle unzugänglichen STIM1 Domänen werden durch Ca2+ Speicherentleerung exponiert. Im Zuge dieses Projekts wurde ein neuer, methodischer Ansatz (FRET-derived Interaction in a Restricted Environment FIRE) entwickelt, um die einzelnen Stufen des CRAC Aktivierungsprozesses sowie das detaillierte Zusammenspiel der darin involvierten Domänen aufzuklären. Das Hauptaugenmerk liegt dabei auf homo- und heteromeren Interaktionen einzelner a-helikaler Bereiche innerhalb der coiled coil (CC) Domänen von STIM1. Eine heteromere CC1a1-CC3 Interaktion bedingt den inaktiven Zustand von STIM1. Im Gegensatz dazu verursacht ER-Ca2+ Speicherentleerung die verstärkte homomere Interaktion von CC1a1 wodurch die CC1-CC3 Interaktion gelöst wird. In weiterer Folge kommt es zu einer Exposition der zytosolischen CAD/SOAR Domäne, was wiederum zu einer erhöhten Oligomerisierung von STIM1 über CC3 führt. Im Zuge dieser Arbeit sollen unter anderem Aminosäuren identifiziert werden, die für diese Oligomerisierung verantwortlich sind. Punktmutationen einzelner Aminosäuren oder Deletionen von bestimmten Bereichen innerhalb CC1a1 unterbinden in ähnlicher Weise die heteromere Interaktion mit CC3 und resultieren in einem vergleichbar aktiven physiologischen Zustand von STIM1. Eine kürzlich entdeckte CC1 Mutation, welche sich phänotypisch im Stormorken Syndrom äußert, wird unter anderem dazu beitragen, die molekularen Mechanismen der STIM1 Aktivierung aufzuklären. Im vorliegenden Projektantrag wird versucht, jene STIM1 Aktivierungsvorgänge aufzuklären, die sowohl die Exposition als auch die Clusterbildung von CAD/SOAR kontrollieren, unabdingbar für die Bindung an und Aktivierung von Orai1 Kanälen.

Speicher abhängiger Ca2 Einstrom ist essentiell für die Anschaltung und Aufrechterhaltung einer effektiven Immunantwort. Ca2 Einstrom erfolgt über sogenannte CRAC Kanäle in der Plasmamembran, welche durch das Zusammenspiel von STIM1 und Orai1 geöffnet werden. Diese Aktivierungskaskade wird durch STIM1 initiiert, welches im endoplasmatischen Retikulum lokalisiert ist und mittels seiner zytosolischen Domänen (CAD/SOAR) direkt an den Ionenkanal Orai1 in der Plasmamembran bindet und diesen in weiterer Folge aktiviert. Diese im Ruhezustand der Zelle unzugänglichen STIM1 Domänen werden durch Ca2 Speicherentleerung exponiert. Im Zuge dieses Projekts wurde ein neuer, methodischer Ansatz (FRET-derived Interaction in a Restricted Environment FIRE) entwickelt, um die einzelnen Stufen des CRAC Aktivierungsprozesses sowie das detaillierte Zusammenspiel der darin involvierten Domänen aufzuklären. Das Hauptaugenmerk lag dabei auf homo- und heteromeren Interaktionen einzelner a-helikaler Bereiche innerhalb der coiled coil (CC) Domänen von STIM1. Eine heteromere CC1a1-CC3 Interaktion bedingt den inaktiven Zustand von STIM1. Im Gegensatz dazu verursacht ER-Ca2 Speicherentleerung die verstärkte homomere Interaktion von CC1a1 wodurch die CC1-CC3 Interaktion gelöst wird. In weiterer Folge kommt es zu einer Exposition der zytosolischen CAD/SOAR Domäne, was wiederum zu einer erhöhten Oligomerisierung von STIM1 über CC3 führt. Punktmutationen einzelner Aminosäuren oder Deletionen von bestimmten Bereichen innerhalb CC1a1 unterbinden in ähnlicher Weise die heteromere Interaktion mit CC3 und resultieren in einem vergleichbar aktiven physiologischen Zustand von STIM1. Eine kürzlich entdeckte CC1 Mutation, welche sich phänotypisch im Stormorken Syndrom äußert, wurde hinsichtlich ihres molekularen Mechanismen der STIM1 Aktivierung aufgeklärt. Im vorliegenden Projektantrag wurden jene STIM1 Aktivierungsvorgänge aufgeklärt, die sowohl die Exposition als auch die Clusterbildung von CAD/SOAR kontrollieren, unabdingbar für die Bindung an und Aktivierung von Orai1 Kanälen.