Enzymatische Synthese von RNA-Microarrays und RNA Aptamer Applikationen

Ziel dieses Projektes ist es, ein leistungsfähiges neues Verfahren zur Synthese von High-Density- Microarrays von langen RNA-Oligonukleotiden für Anwendungen in der molekularen RNA Zellbiologie und im Bereich von RNA-Aptamer-Biosensoren zu entwickeln, und deren Verwendung für Studien zur Identifizierung von Bindungsspezifitäten und -affinitäten von RNA-bindenden Molekülen zu zeigen. Die RNA-Microarrays sollen enzymatisch aus sog. template-Microarrays aus langen DNA- Oligonukleotiden (60 bis 100mers) synthetisiert werden. Die template-Microarrays sollen mittels herkömmlicher in situ-Synthesen hergestellt und anschließend durch Primer-Extension mit Hilfe einer TGK-DNA-Polymerase doppelsträngig synthetisiert werden. Die TGK-Polymerase ist durch zwei spezifische Mutationen gekennzeichnet, die eine effiziente Transkription von DNA in RNA über Primerverlängerung mit Ribonukleotidtriphosphate erlaubt. Die Primer sind kovalent an die Microarray-Oberfläche gebunden, so dass die RNA an der Stelle der Synthese auch nach dem enzymatischen Abbau des DNA-template gebunden bleibt. In Vorversuchen hat sich dieses Verfahren als effizient und effektiv gezeigt. Die vorgeschlagenen Experimente sollen die Entwicklung von alternativen Bindungsmethoden für Primer, sowie die Entwicklung von verschiedenen enzymatischen Wegen für den Abbau der DNA- templates ermöglichen. Die hier erzielten Ergebnisse sollen als Grundlage für die Entwicklung eines praktischen und robusten Verfahrens zur Umwandlung von DNA-Microarrays in RNA -Microarrays dienen. Für dieses Projekt sollen DNA-Microarrays mit bis zu 780.000 verschiedenen Sequenzen mittels sog. Maskless Array Synthesis (MAS) hergestellt und in RNA umgewandelt werden. Die RNA- Mikroarrays sollen anschließend verwendet werden, um die für die Bindungsspezifität und Affinität essenziellen Sequenz- und Strukturmerkmale des zyklischen di-GMP Riboswitch Aptamer von Vibrio Cholera riboswitch zu identifizieren.

Ziel dieses Projektes war es, ein leistungsfähiges neues Verfahren zur Synthese von langen RNA-Oligonukleotiden mittels High-Density-Microarrays für Anwendungen in der molekularen RNA- Zellbiologie und im Bereich von RNA-Aptamer-Biosensoren zu entwickeln, und deren Verwendung für Studien zur Identifizierung von Bindungsspezifitäten und -affinitäten von RNA-bindenden Molekülen zu zeigen. Die RNA-Microarrays erlauben die enzymatische Synthese von langen DNA- Oligonukleotiden (60 bis 100mers) aus sog. template-Microarrays. Diese template- Microarrays werden mittels herkömmlicher in situ-Synthesen hergestellt und anschließend durch Primer-Extension mit Hilfe einer TGK-DNA-Polymerase doppelsträngig synthetisiert. Die hierbei eingesetzte TGK-Polymerase ist durch zwei spezifische Mutationen gekennzeichnet, die eine effiziente Transkription von DNA in RNA über Primerverlängerung mit Ribonukleotidtriphosphate erlaubt. Diese Primer sind kovalent an die Microarray- Oberfläche gebunden, sodass die RNA an der Stelle der Synthese auch nach dem enzymatischen Abbau des DNA-template gebunden bleibt. Die erzielten Ergebnisse ermöglichen die Entwicklung von alternativen Bindungsmethoden für Primer, sowie die Entwicklung von verschiedenen enzymatischen Wegen für den Abbau der DNA-templates. Weiterhin haben die hier erarbeiteten Ergebnisse dazu geführt, ein praktisches und robustes Verfahrens zur Umwandlung von DNA-Microarrays in RNA - Microarrays zu entwickeln. Für wurden Projekt sollen DNA-Microarrays mit bis zu 780.000 verschiedenen Sequenzen mittels sog. Maskless Array Synthesis (MAS) hergestellt und in RNA umgewandelt. Die RNA- Mikroarrays wurden anschließend für die Identifizierung von den für die Bindungsspezifität und affinität essenziellen Sequenz- und Strukturmerkmalen des zyklischen di-GMP Riboswitch Aptamer von Vibrio Cholera riboswitch.