Mikrodiversität unkultivierte nitritoxidierender Bakterien

Die Nitrifikation ist ein Schlüsselprozess des biogeochemischen Stickstoffkreislaufs und der biologischen Abwasserreinigung. Dennoch weiß man nur wenig über die involvierten Organismen ammoniakoxidierende Bakterien (AOB) und Archaea, und nitritoxidierende Bakterien (NOB) und ihre Stoffwechseleigenschaften,ökologischeNischendifferenzierung,sowieInteraktionen untereinander und mit nicht-nitrifizierenden Organismen. Insbesondere ist fast nichts über die detaillierte Populationsstruktur (Mikrodiversität), genomische Plastizität, und phänotypische Merkmale innerhalb von Gruppen sehr nah verwandter Nitrifizierer bekannt. Erst vor wenigen Jahren wurde Mikrodiversität als ein Charakteristikum vieler mikrobieller Lebensgemeinschaften in natürlichen und technischen Systemen identifiziert. Als Folge dieser Entdeckung wurden Studien zur mikrobiellen Populationsgenetik und Artbildung vertieft und ökologische Aspekte, wie die Nischendifferenzierung funktionell redundanter koexistierender Populationen, verstärkt untersucht. Das Fehlen von Einblicken in die Mikrodiversität der Nitrifizierer steht im Widerspruch zur großen ökologischen Bedeutung dieser Organismen, welche essentielle Prozesse in fast allen natürlichen Ökosystemen und in Kläranlagen katalysieren. Dieses Projekt nutzt eine großtechnische Kläranlage als Modell-Ökosystem zum Studium der Mikrodiversität von NOB, die im selben Belebtschlamm koexistieren. Angewandt wird ein umfassender Ansatz aus Genomanalysen, Populationsgenetik, und in situ physiologischen Analysen auf Einzelzellebene. Grundlage ist ein neuer Weg zur Identifizierung, Extraktion, und Genomsequenzierung von Zellaggregaten (Mikrokolonien) von Nitrifikanten aus Belebtschlamm mittels Raman-Mikrospektroskopie, Laser-Mikromanipulation und Einzelzellgenomik. Mit dieser bereits etablierten Methode werden ~50 "Mikrokolonie-Metagenome" von NOB und ~50 solcher Metagenome von AOB schon vor Projektstart sequenziert, so dass dieser große Genomdatensatz direkt verfügbar ist. Durch hochauflösende populationsgenetische Analysen dieser Genome wird die Populationsstruktur mikrodiverser NOB dargestellt. Genombasierte Hypothesen zu (eventuell neuartigen) nischen-spezifischen physiologischen Eigenschaften von NOB-Gruppen werden in situ experimentell getestet; dabei kommen Einzelzell-Isotopentechniken wie Raman-Mikrospektroskopie, Mikroautoradiographie und NanoSIMS zum Einsatz. Symbiosen von AOB mit NOB werden mittels Genomik, in situ-Experimenten, und räumlichen Koaggregationsanalysen untersucht und ihre Spezifität für mikrodiverse Populationen aus beiden funktionellen Gruppen bestimmt. Die Genome räuberischer Bakterien und anderer heterotropher Symbionten, welche an die sortierten NOB- Mikrokolonien angeheftet waren, werden mit sequenziert und liefern interessante Informationen über Interaktionen von NOB mit Heterotrophen, welche experimentell bestätigt werden können. Das Projekt wird erstmals ein detailliertes Bild mikrodiverser NOB-Populationen liefern, mitsamt ihrer phylogenetischen Struktur, genomischen Plastizität, und physiologischen Vielfalt. Weiterhin wird es ein wichtiger konzeptioneller Fortschritt in der Mikrodiversitäts-Forschung, da zielgerichtete "omics"-basierte Analysen mit in situ Studien kombiniert werden und so die ökologische Bedeutung von Mikrodiversität in einem komplexen mikrobiellen Ökosystem untersucht werden kann.

Nitrifikation, die Oxidation von Ammoniak zu Nitrat, ist ein wichtiger Prozess des Stickstoffkreislaufs in der Natur und in Abwasser- und Trinkwasseraufbereitungsanlagen. Sie verursacht jedoch auch Stickstoffverluste aus gedüngten Böden. Die Nitrifikation ist ein zweistufiger Prozess: Ammoniak wird von Ammoniak-oxidierenden Mikroorganismen zu Nitrit oxidiert, das von Nitrit-oxidierenden Bakterien (NOB) weiter zu Nitrat umgesetzt wird. Das Wissen über die Biologie von NOB ist begrenzt, da die meisten Arten nicht im Labor kultiviert werden können. In diesem Projekt wurden Mikrokolonien von NOB-Zellen durch Mikromanipulation aus Belebtschlamm sortiert und ihre Metagenome sequenziert, um die genomische Mikrodiversität eng verwandter NOB zu untersuchen. Überraschenderweise enthielt die untersuchte Kläranlage nur eine geringe Diversität von NOB der Gattung Nitrospira, die zu lediglich drei Arten gehörten. Interessanterweise wurde jedoch ein neuartiges Riesenvirus in dem metagenomischen Sequenzdatensatz identifiziert. Dieses Virus infiziert wahrscheinlich eukaryotische Mikroorganismen und hat sich durch massiven Transfer von Wirtsgenen aus einem viel kleineren Virus entwickelt. Darüber hinaus wurde die erste Reinkultur der NOB-Gattung Nitrotoga aus Belebtschlamm isoliert. Physiologische und genomische Analysen ergaben, dass Nitrotoga sich unabhängig von anderen NOB entwickelt hat und alternative Stoffwechselwege besitzt, wie die Wasserstoff (H2)-Oxidation, die ein Überleben unter Nitrit-armen Bedingungen ermöglichen können. Das wichtigste Ergebnis war die unerwartete Entdeckung, dass Arten der Gattung Nitrospira sowohl die Ammoniak- als auch die Nitritoxidation katalysieren. Diese Bakterien werden "comammox" genannt. Ihre Entdeckung widerlegt ein Lehrbuchparadigma, wonach für die komplette Nitrifikation zwei verschiedene Mikroben erforderlich seien. Comammox-Bakterien kommen sowohl in Böden und Süßwasser-Ökosystemen als auch in Abwasser- und Trinkwasseraufbereitungsanlagen vor. Physiologische Analysen der ersten Comammox-Reinkultur ergaben eine extrem hohe Affinität für das Substrat Ammoniak, womit Comammox viele andere Ammoniakoxidierer in terrestrischen und technischen Habitaten verdrängen könnte. Auch stellte sich heraus, dass Comammox langsam wächst, aber mehr Biomasse als andere Ammoniakoxidierer und NOB bildet. Basierend auf diesen Erkenntnissen können Strategien entwickelt werden, um Comammox-Populationen in Systemen zu fördern, wo die komplette Nitrifikation durch einen Organismus Vorteile bietet. Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) mit rRNA-gerichteten DNA-Sonden wird verwendet, um Mikroben in Umweltproben nachzuweisen. Hier wurde eine neue Multicolor-FISH-Technik entwickelt, die den simultanen Nachweis von mehr Mikrobenpopulationen ermöglicht als das Standard-FISH-Protokoll. Zusammen mit neu entwickelten FISH-Sonden zum Nachweis von Ammoniak-oxidierenden Bakterien wird diese Methode zukünftige Studien zur Nitrifikation in Abwasser und anderen aquatischen Systemen erleichtern.