FT-ICR Massenspektrometrie von modifizierter RNA und Proteinen

Die Massenspektrometrie (MS) ist von zentraler Bedeutung für die Identifizierung von Proteinenmittels Hochdurchsatz-Peptidsequenzierung("bottom-up" MS); zur umfangreichenSequenzierungvonRibonukleinsäuren (RNA) dagegen werden üblicherweise andere Techniken als MS verwendet. Durch die kürzlich gewonnene Erkenntnis, dass posttranskriptionale Modifikationen von nicht-kodierender RNA und posttranslationale ModifikationenvonProteinen eine wesentliche Rolle in der Genexpression spielen, wurde der Bedarf an neuen Methoden zur Identifizierung, Lokalisierung und relativen Quantifizierung von RNA- und Proteinmodifikationen deutlich. Die "Top-down" Massenspektrometrie ist dafür besonders geeignet, da sie jegliche Änderungen der Masse von RNA oder Proteinen detektieren und potentiell alle Korrelationen, die zwischen Modifikationen bestehen, aufdecken kann. Im Rahmen dieses Projekts werden mechanistische Studien zur Dissoziation von RNA und Proteinen durchgeführt und basierend darauf neue "top-down" und "middle-down" MS Ansätze zur umfangreichenCharakterisierungvon posttranskriptionalenund synthetischen Modifikationen von RNA und posttranslationalen Modifikationen von Proteinen entwickelt und validiert werden. Ausgewählte, biologisch relevante RNA und Proteine werden dann mit diesen neu entwickelten Methoden in einem Fourier-Transformation Ionen-Zyklotron- Resonanz Massenspektrometer (FT-ICR MS) untersucht werden, um Informationen über das "correlated editing" von RNA und die "combinatorial codes" von Proteinen zu erhalten.

Modifikationen von Ribonukleinsäuren (RNA) und Proteinen spielen eine wichtige Rolle in der Regulierung der Genexpression und der Entwicklung von RNA-basierten Therapeutika, aber ihre Identifizierung, Lokalisierung und relative Quantifizierung mit konventionellen biochemischen Methoden kann sehr schwierig sein. Eine vielversprechende Alternative sind Methoden, die auf Massenspektrometrie (MS) und der Dissoziation von RNA oder Proteinen in der Gasphase basieren. Für die Entwicklung solcher Methoden ist das Verstehen der Dissoziationsmechanismen von unmodifizierter und posttranskriptional, posttranslational, oder synthetisch modifizierter RNA und Proteinen wesentlich. In diesem Projekt haben wir mechanistische Studien der RNA- und Protein-Dissoziation durchgeführt und den Effekt einer Vielzahl von Modifikationen auf die Rückgratspaltung von RNA und Proteinen untersucht. Unsere Studien von Peptiden haben eine jahrzehntealte Kontroverse über den Mechanismus der Elektronen-Einfang-Dissoziation aufgelöst und gezeigt, dass die für die Rückgratspaltung von Peptiden und Proteinen verantwortliche positive Ladung grundsätzlich kein Natrium- oder anderes Metallion anstelle eines Protons sein kann. Darüberhinaus konnten wir zeigen, dass MS zur Identifizierung, Lokalisierung und relativen Quantifizierung von biologisch relevanten Nukleobase-Modifikationen genutzt werden kann, und in gasförmigen RNA Ionen entdeckten wir intrinsische Präferenzen für spezifische Nukleobase-Phosphat-Wechselwirkungen, die eine hohe Ähnlichkeit zu denen in selbst-spaltender RNA in Lösung aufweisen (z.B. Ribozymen).