Molekulare Interaktionsbasis von pyruvyliertem Zellwandpolymer

Verschiedene Gram-positive Bakterien nützen zur Zelloberflächen-Sortierung von Proteinen die Interaktion zwischen Surface-Layer Homologie (SLH) Domänen der Proteine und Peptidoglykan-assoziiertem, pyruvyliertem sekundärem Zellwandpolymer (SCWP) als Zellwand-Ligand. Während an N-Acetylmannosamin gebundenes Pyruvatketal im Rückgrat des SCWP als wichtiges und angestammtes Epitop für diese Bindungs- interaktion angesehen wird, ist ihre molekulare Basis weitgehend unerforscht. Entsprechend unserer Hypothese sind bestimmte Strukturmerkmale von exponiertem Pyruvatketal und der Aminozuckerreste in den SCWP-Wiederholungseinheiten für die Interaktion mit SLH-Domänen ausschlag- gebend. Zur Aufklärung der molekularen Basis dieser Bindungsinteraktion soll das stöchiometrisch definierte SCWP von Paenibacillus alvei in Verbindung mit dem 2D kristallinen S-Schichtprotein SpaA, einem SLH Domänen-enthaltenden in vivo Bindungspartner, als gut erfassbares Modell herangezogen werden. Der derzeitige Wissensstand über das SCWP / SpaA Interaktionspaar von P. alvei (Projekte P21954, P22791) ist die Basis für dieses Forschungsvorhaben: a) SCWP besteht aus circa zehn (3-beta-D-ManNAc-1,4- beta-D-GlcNAc-1) Wiederholungseinheiten wobei jeder ManNAc Rest mit 4,6-gebundenem Pyruvatketal modifiziert ist. b) Die Modellierung der SLH-Region von SpaA, basierend auf der Kristallstruktur der entsprechenden Region des S-Schichtproteins von B. anthracis, zeigt ein Pseudotrimer mit Anordnung der SCWP-Bindungsaminosäuren am Übergang zwischen den drei SLH-Domänen. c) Erste Kristalle der SLH- Region von SpaA wurden erhalten; diese sind der Ausgangspunkt für Ko-Kristallisationsstudien mit SCWP. d) Im chromosomalen SCWP-Biosyntheselocus ist die Pyruvyltransferase CsaB von P. alvei kodiert; diese steht für in-vitro Pyruylierungsreaktionen in rekombinanter Form zur Verfügung. In einem bottom-up Ansatz mit synthetischen SCWP-Fragmenten und verkürztem, löslichem SpaA Protein soll eine biologische Interaktionseinheit bestimmt, charakterisiert und als Ko-Kristall analysiert werden. Dieses Projekt basiert auf dem Synergismus aus chemischen, biochemischen, genetischen und kristallogra- phischen in-vitro Ansätzen zur Erforschung der molekularen Interaktionsbasis zwischen pyruvyliertem SCWP und SLH-Domänen von Proteinen in P. alvei. Der konkrete Beitrag des Pyruvats wird durch den Vergleich mit carboxyl-reduzierten Substraten ermittelt. An depyruvylierten synthetischen SCWP Fragmenten unterschied- licher Länge wird die Pyruvylierung von ManNAc untersucht, um Rückschlüsse auf die SCWP Biosynthese ziehen zu können. Dieses Projekt trägt zum Verständnis der Verankerung von SLH Domänen-enthaltenden Proteinen an der Zelloberfläche von Bakterien bei und leistet damit einen Beitrag zum detaillierteren Verständnis ihres Zellwand- aufbaus. Die zu Grunde liegenden Interaktionen können einen wertvollen Ausganspunkt zum Maßschneidern von Bakterienoberflächen beziehungsweise zur Entwicklung therapeutischer Maßnahmen gegen Pathogene darstellen. Es könnte sein, dass der untersuchte Bindungsmechanismus häufiger auftritt als derzeit angenommen wird, da die Pyruvylierung von SCWPs durch die zur Isolierung häufig verwendete Säurebehandlung verloren gehen könnte.

P27374 - Molekulare Interaktionsbasis von pyruvyliertem Zellwandpolymer Bakterien nutzen ausgeklügelte Strategien, um ihre Oberfläche mit Eiweißmolekülen (Proteinen) zu überziehen, die dann bestimmte Funktionen, wie Schutz vor Umgebungs-einflüssen oder Pathogenität vermitteln können. Dieses Projekt untersuchte die molekularen Details eines vermutlich weit verbreiteten aber weitgehend unaufgeklärten Mechanismus zur Oberflächen-Verankerung von Proteinen, der das Potenzial besitzt, für neue antibakterielle Ansätze herangezogen zu werden. Dabei wechselwirken Proteine, die ein bestimmtes Faltungsdetail aufweisen, nämlich ein sogenanntes SLH-Trimer, mit einer Zuckerkette, die in der bakteriellen Zellwand verankert ist (Zellwandglykopolymer). Dieses Zellwandglykopolymer ist aus Wiederholungseinheiten von zwei Aminozuckern aufgebaut, von denen der N-Acetylmannosaminrest mit einer Säure (Pyruvat) modifiziert ist. Dem Projekt liegt die Annahme zu Grunde, dass diese Modifikation entscheidend für die Wechselwirkung mit dem Protein ist. In einer Kombination von proteinbiochemischen, zellulären, analytischen und kristallographischen Ansätzen gelang es in einer internationalen Kooperation zwischen Forschungsgruppen der Universität für Bodenkultur Wien und der University of Victoria, Kanada, die kleinste biologische Wechselwirkungseinheit zwischen dem SLH-Protein und dem Zellwandglykopolymer zu charakterisieren. Dazu wurden verschiedene Biosyntheseintermediate des Polymers des Modellbakteriums Paenibacillus alvei chemisch synthetisiert und mit einem rekombinant hergestelltem SLH-Oberflächenprotein des Bakteriums in biophysikalischen und kristallographischen Studien untersucht. Es hat sich gezeigt, dass endständiges, modifiziertes N-Acetylmannosamin das Bindungsepitop für die SLH-Domäne des Proteins darstellt, wobei auch die Bindungsaminosäuren ermittelt wurden. Bemerkenswert ist die Rolle der konservierten Aminosäure Glycin an Position 29 (SLH-Gly29), welche eine gewisse Flexibilität der Verankerung des Proteins ermöglicht. Dies ist in biologischer Hinsicht sinnvoll, da bakterielle Zelloberflächen dynamische Strukturen sind. Basierend auf der gewonnenen Erkenntnis, dass die Modifikation des N-Acetylmannosaminrestes entscheidend für die Ligandenwirkung des Zellwandglykopolymers ist, wurde auch das für die Modifikation zuständige Enzym - die Pyruvyltransferase CsaB - identifiziert und untersucht. Dazu wurde der Biosyntheseweg einer Zellwandglykopolymer-Zwischenstufe unter Einbeziehung der rekombinanten Enzyme TagA und CsaB von P. alvei unter Laborbedingungen rekonstituiert. Es konnte gezeigt werden, dass das Enzym auf der Stufe der Lipid-gebundenen Wiederholungseinheit aktiv ist. Zudem wurde der die genetische Information für die vollständige Biosynthese des Zellwandglykopolymers enthaltende Lokus auf dem bakteriellen Genom identifiziert, was weiterführende Studien ermöglicht. Da der im Rahmen des Projekts untersuchte Proteinverankerungsmechanismus auch im Milzbranderreger Bacillus anthracis verwirklicht ist, haben die erhobenen Daten Relevanz über den Grundlagenforschungsbereich hinaus, indem sie neue antibakterielle Ansätze aufzeigen.