Typ IV Sekretionssysteme (T4SS) in Gram-positiven Bakterien

Bakterielle Konjugation ist der Hauptmechanismus für die Verbreitung von Antibiotika Resistenzen und Virulenzgenen und stellt folglich eine erhebliche Gefahr für die menschliche Gesundheit dar. Bisher stehen detaillierte Informationen nur für Gram-negative (G-) Typ-IV Sekretionssysteme (T4SS) zur Verfügung. Obwohl viele medizinisch relevante Krankheitserreger Gram-positive (G+) Bakterien sind, haben deren Konjugationssysteme bisher nur geringe Aufmerksamkeit erhalten. G+ Bakterien besitzen im Vergleich zu G- Bakterien nur eine Zytoplasma-Membran, dafür aber eine bedeutend dickere, mehrschichtige Peptidoglycan-Hülle. Auf Basis dieser wesentlichen Unterschiede der Zellwand schlagen wir vor, dass T4SS aus G+ Bakterien, verglichen mit G- T4SS, eine markant unterschiedliche Architektur aufweisen. Unsere Hypothese werden wir mit den folgenden beiden G+ T4S Modellsystemen überprüfen: Die konjugative Transferregion des Antibiotika Resistenzplasmids pIP501 besitzt das breiteste Wirtsspektrum für Plasmidtransfer in G+ Bakterien (z.B. Enterokokken, Staphylokokken und Streptokokken) und kodiert für fünfzehn putative Transferproteine. Das Sex-Pheromon-Plasmid pCF10 aus Enterococcus faecalis beinhaltet ein zum Teil charakterisiertes, jedoch von pIP501 sehr unterschiedliches T4SS, welches wir ebenfalls untersuchen und mit dem pIP501 System vergleichen wollen. Die Funktionen von vier der fünfzehn pIP501 Transferproteine konnten bereits bestimmt werden: TraA ist eine Relaxase; das VirB4-ähnliche TraE und das VirD4-ähnliche Coupling-Protein TraJ zeigen beide ATPase Aktivität; das VirB1-ähnliche Protein TraG ist eine Muramidase. Drei der pIP501 T4SS Komponenten konnten schon kristallisiert werden und die Strukturen der C-terminalen Domäne von TraM und TraK konnte bereits gelöst werden (Goessweiner-Mohr et al., 2013; Goessweiner-Mohr et al., 2014). Das vorliegende Projekt hat die strukturelle Charakterisierung der essentiellen Muramidase TraG, der N- terminalen Domäne bzw. des vollständigen Transferproteins TraM sowie der ATPase TraE zum Ziel. Zusätzlich werden wir die entsprechenden Proteine aus dem T4SS des Sex-Pheromon-Plasmids pCF10 untersuchen. Gen-spezifische Knock-out-Studien werden in unseren Partner-Labors durchgeführt werden und werden zur Identifizierung weiterer essentieller Komponenten der Transfersysteme von pIP501 und pCF10 führen. Weiters werden wir versuchen, anhand bereits begonnener Co-Expressionsversuche die Transferkernkomplex-Komponenten der beiden T4SS zu identifizieren. Sobald erste, stabile Komplexe charakterisiert sind, werden wir diese mit elektronenmikroskopischen und kristallographischen Methoden untersuchen. Unser Ziel ist es, den ersten T4SS Kernkomplex (core complex) eines G+ pathogenen Bakteriums zu charakterisieren. Dieses Projekt ist in hohem Maße interdisziplinär und vereinigt genetische, immunologische und funktionelle Experimente (Knock-out- und Komplementierungs-Studien, transfer DNA Immuno- Precipitation (TrIP), Opsonophagocytose-Assay (OPA), Mating Assays), die teilweise in unseren Partner- Labors durchgeführt werden, mit Klonierungs-, biophysikalischen and strukturellen Untersuchungen (Löslichkeits-Screens, CD, SAXS, Kristallographie, EM). 1

Konjugativer DNA-Transfer ist der am weitesten verbreitete Mechanismus für die Verbreitung von Antibiotika-Resistenzen zwischen Bakterien. Der Transfer wird durch einen multi- Proteinkomplex, das Typ IV Sekretions-System(T4SS) bewerkstelligt, welches die bakterielle Zellwand überbrückt. Das Hauptziel dieses Projektes war die Charakterisierung der Struktur-Funktions-Beziehung essentieller Transferproteine, die im tra-Operon des T4SS von pIP501, einem Multi- Resistenz-Plasmid von Enterococcus faecalis enthalten sind. Dies wurde durch eine Kombination von mehreren experimentellen Methoden erreicht: (i) Strukturaufklärung mit Hilfe von Kristallographie , NMR und Elektronenmikroskopie; (ii) molekularbiologische Methoden umfassten die Klonierung und Expression von ausgewählten Tra-Proteinen, die Messung des Effekts von Deletions-Mutanten auf mRNA- und Protein-Expression; (iii) biochemische Methoden umfassten in vivo und in vitro cross-linking, Expression und Isolation des assembl ierten T4SS und die Identifikation seiner Komponenten durch Western-Blotting. Unter Anderem wurde von den folgenden Komponenten deren Struktur und/oder Funktion bestimmt: TraH, TraN-DNA Komplex und TraF. Für einige zusätzliche Tra- Proteine sind die Untersuchungen noch im Gange (z.B. TraM N-terminale Domäne und TraA). Die spezifischen, binären Interaktionen zwischen den Tra-Proteinen, die schon im Rahmen einer Yeast-two-hybrid Studie untersucht worden waren, wurden mit Hilfe eines Bacterial- two-hybrid (BACTH) Assays neu evaluiert. Als Resultat konnte ein neues lnteraktionsmodell der Tra-Proteine erstellt werden, das Hinweise auf die wahrscheinliche Zusammensetzung des T4SS Komplexes liefert. Deletions-Studien (Knock-out Mutanten) führten einerseits zur Identifikation essentieller Tra-Proteine und andererseits zur Charakterisierung eines neuen Repressors und Regulators des tra-Operons, TraN. Ein anderes, im Vorgängerprojekt charakterisiertes Tra-Protein, TraM, wurde als potentieller Vakzine-Kandidat untersucht, da Antikörper gegen dieses Protein zur Erkennung und Abtötung von plP501-positiven Enterokokken führten Diese Ergebnisse sind ein essentieller Beitrag zum Verständnis der Mechanismen, die für DNA-Transfer und Austausch genetischer Informationen innerhalb dieser wichtigen Bakteriengruppe verantwortlich sind. Auf lange Sicht könnte die Aufklärung der 3D-Struktur des T4SS dazu beitragen, weitere Ziel-Proteine zu identifizieren, die für eine Inhibition der Verbreitung von Antibiotika-Resistenzen in G+ Pathogenen genutzt werden können.