Hybrid B Häm Peroxidasen aus thermophilen und mesophilen Pilzen

Hybrid B Häm Peroxidasen (HyBpox) bilden eine neue und spezifische Proteinfamilie eisenhältiger Oxidoreduktasen. Kürzlich durchgeführte phylogenetische Analysen haben gezeigt, dass sie wichtige Knotenpunkte der divergenten Evolution der Peroxidase-Katalase-Superfamilie darstellen. Derzeit sind etwa 100 Protein-kodierende Sequenzen bekannt, die auf interessante Modifikationen in der Architektur des Hämzentrums hinweisen. Die Gene findet man in verschiedenen Pilzen, wobei interessanterweise der Großteil in gefährlichen (phyto)pathogenen Schlauch- & Ständerpilzen vorkommt. Es konnte bereits gezeigt werden, dass orthologe hyBpox Gene in phytopathogenen Pilzen und diversen Bodenpilzen exprimiert werden und dass die Expression durch oxidativen Stress induziert werden kann. Im vorliegenden Projekt sollen Struktur-Funktionsbeziehungen dieser Enzymfamilie untersucht werden. Drei Verteter wurden ausgewählt, nämlich MagHyBpox1 aus dem Reis-Pathogen Magnaporthe oryzae, CgHyBpox2 aus den Bodenpilz Chaetomium globosum und CtheHyBpox aus einem thermophilen Pilz (Chaetomium thermophilum). Vorversuche zur Expression der entsprechenden synthetischen Gene in Pichia pastoris und zur Reinigung der Proteine verliefen vielversprechend. Nach Produktion der rekombinanten Enzyme (Wildtyp und designte Mutanten) sollen die Metalloproteine umfangreich biochemisch und biophysikalisch charakterisiert werden (UV- Vis-, CD-, EPR-Spektroskopie, Spektroelektrochemie, Multimixing Stopped-flow Spektroskopie, Röntgen-kristallographie etc.). Basierend auf diesen strukturellen (und mechanistischen) Daten und computergestützten Docking-Experimenten werden dann potenzielle Inhibitoren eruiert, die an sekretorischen Hybrid B Häm Peroxidasen (phytopathogener) Pilze getestet werden sollen.

Peroxidasen sind essentielle Oxidoreduktasen die für die Spaltung der peroxidischen Bindung in vielen für die Zellen potentiell gefährlichen und sehr reaktiven Substanzen verantwortlich sind. Alle bekannte Peroxidasen kann man zwischen die Häm-hältigen und nicht-Häm Peroxidasen gliedern. Fast alle Häm Peroxidasen sind in vier verschiedene Superfamilien klassifiziert. Hybrid B Häm-hältige Peroxidasen sind eine völlig neu entdeckte Oxidoreduktase Subfamilie der vorher definierten Peroxidase-Katalase Superfamilie. Die Sequenzen von Hybrid B Peroxidasen als eine monofyletische Gruppe sind evolutionär zwischen bereits gut bekannten Vertreter der Familie II (Mangan- und Lignin Peroxidasen) und Familie III (pflanzliche sekretorische Peroxidasen) positioniert. In Rahmen dieses Projektes waren ausgewählte Representanten dieser Häm b Peroxidasen aus verschiedenen Pilzen auf molekularer Ebene untersucht. Zuerst haben wir die native Expression von mehreren hyBpox Genen aus filamentösen Pilzen unter verschiedenen physiologischen Konditionen untersucht. Es hat sich herausgestellt, daß die entsprechende mRNA- Transkripte davon durch verschiedene Arten von oxidativem Stress signifikant induziert werden. Wir haben nachher drei typische Gene in Genomen von 2 mesophilen und 1 thermophilen filamentösen Pilz ausgewählt und davon Kodon-optimierte Versionen für die heterologe Expression in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris produziert. Nach der sekretorischen Expression haben wir die rekombinante Häm-hältige Peroxidasen über Affinitätsäulen und nachher über Ionen-Austauscher Säule und molekularen Sieb gereinigt. Die so hoch gereinigte Proben waren mit verschiedenen biophysikalischen und biochemischen Methoden untersucht. Durch Circular Dichroism haben wir den Inhalt von sekundären Strukturelementen untersucht um diese mit schon vorher bekannten Peroxidasen zu vergleichen. Dann haben wir die Reaktionskinetik mit bis zu 12 verschiedenen Elektron Donoren photometrisch und fluorimetrisch untersucht und auch mit vorher beschriebenen Peroxidasen kompariert. Aus genauer Sequenzuntersuchung von Hybrid B Häm Peroxidasen hat sich herausgestellt, daß diese neben einer hochkonservierten Häm Domäne auch noch zusäztliche Domänen enthalten die scheinbar keine peroxidatische Aktivität zeigen. Wir haben diese Domänen entweder zu Zuckerbindenden Motiven (so genannte CBM - klassifizierbar in CAZy Database) oder zu stressabhängigen Domänen mit wasser-löslischen Zucker (WSC) zugeordnet. Davon kann man auch die wahrscheinliche physiologische Funktion von diesen unikaten Hybrid Peroxidase-Zucker bindenden Fusionsproteinen hauptsächlich in verschiedenen pathogenen Pilzen deduzieren.