Konformationsänderungen im Orai-Ionenkanal, die zu dessen Öffnung beitragen

Der speicherabhängige Kalzium-Ionenkanal, der sogenannte CRAC-Kanal, ist für die Kalzium Aufnahme in einer Vielzahl von Zellarten verantwortlich. Dieser kontrolliert eine Reihe von zellulären Signalisierungsprozessen wie u.a. das Zellwachstum, die Genexpression und die Aktivierung von Immunzellen. Zwei Proteine, STIM1, ein Kalziumsensor im endoplasmatischen Retikulum und Orai1, ein Kalziumionenkanal in der Zellmembran, formen gemeinsam den CRAC-Ionenkanal. Für die Aktivierung des Orai1 Kanals wird eine C-terminale STIM1 Kopplung an den N- und den C-terminus of Orai vermutet. Wir möchten hier jene mechanistischen Schritte identifizieren, welche zur Öffnung von Orai1 durch STIM1 führen. Im Speziellen analysieren wir wie die STIM1 Bindung i) die Orientierung der C-termini steuert, ii) die Orientierung von Orai1-Transmembrane(TM)-Helices verändert und wie dies iii) zur Öffnung der Pore führt. Dafür verwenden wir einen kombinierten Ansatz von funktionellen und biochemischen Studien, welche durch Molekular Dynamik (MD)- Simulationen und NMR-Messungen unterstützt werden. Zuerst werden Simulationen und in-vitro Studien an Punktmutanten durchgeführt, die darauf abzielen, die für die Öffnung von Orai1 relevanten Aminosäuren und/oder intramolekulare Interaktionen zwischen TM3 und TM4 zu identifizieren. Erste Experimente zeigen, dass spezifische Mutationen in TM2 (H134), TM3 (V181) und TM4 (P245) einen konstitutiven Kalzium-Einstrom bewirken, die auf eine Interaktion von benachbarten TM-Bereichen untersucht werden. Offensichtlich tragen diese Aminosäuren dazu bei, den Orai1-Kanal im geschlossenen Zustand zu halten. Wir werden unsere Hypothese überprüfen, ob die STIM1-Bindung an den Orai C-terminus die Orientierung von TM-Helices verändert, damit der Kanal öffnet. In diesem Zusammenhang werden wir Orai1, konstitutiv-aktive Orai1 Mutanten und STIM1-aktivierten Orai1 vergleichen. Nachdem weitere Vorexperimente darauf hinweisen, dass unterschiedliche Schlüsselaminosäuren im intrazellulären loop2 und in TM3 von Orai1 und Orai3 die beiden Kanäle im geschlossenen Zustand halten, versuchen wir zu zeigen, dass die beiden Poren verschiedene Konformationsänderungen eingehen, wenn sie in den offenen Zustand gelangen. Hiermit, möchten wir testen, ob Orai-Proteine ein Isoform-spezifisches Öffnungsverhalten aufweisen. Zusammenfassend, sollen diese Studien molekulare Mechanismen entschlüsseln, die durch STIM1-induzierte Konformationsänderungen an TM-Helices, den Orai1 in den offenen Zustand bringen. Somit wird ein fundamentaler Einblick in die Orai1 Konformationsänderungen vom geschlossenen in den offenen Zustand gewährt.

Kalzium spielt eine vielseitige Rolle im menschlichen Körper wie auch in der einzelnen Zelle. Ein Haupttransportweg für Kalzium in die Zelle wird vor allem durch speicheraktivierte Ionenporen bewerkstelligt, wobei der sogenannte Ca2+ release-activated Ca2+ (CRAC) Ionenkanal von besonderer Bedeutung ist. Die Ionenpore besteht aus zwei Komponenten: ein Ca2+ Sensor-Protein STIM im Kalziumspeicher der Zelle und eine Kalziumionenpore Orai in der Zellmembran. Werden intrazelluläre Kalziumspeicher entleert, koppeln die beiden Proteine aneinander und ermöglichen den Kalziumeintritt in die Zelle. In diesem Projekt untersuchten wir wie das Öffnen der Orai Kalziumpore von umliegenden Ionenkanalbereichen abhängt. Hier wurde der Fokus auf die äußeren Transmembranregionen sowie die zytosolischen Bereiche des Orai-Komplexes, sowie deren Kommunikation mit STIM gelegt. Als wichtige Resultate zum Verständnis des Orai-Kanalkomplexes kann (i) die Identifizierung von funktionell essentiellen STIM-Orai Kommunikationsbereichen, (ii) das Auffinden von Schlüssel-Bereichen/-"hot-spot"-Aminosäuren im Orai1-Kanalkomplex, die das Öffnen der Orai1 Pore ermöglichen, sowie (iii) die Bestimmung von Orai-Untertyp-spezifischen regulatorischen Regionen, gesehen werden. Diese Ergebnisse wurden mit Hilfe eines komplementären Ansatzes aus experimentellen und Molekulardynamik-Simulations-Studien erzielt. Zusammenfassend wurden durch die Identifikation von unversichtbaren wie auch regulatorischen Regionen im STIM/Orai Komplex neuartige Einblicke in die Schaltmechanismen des STIM/Orai Systems erhalten, die eine essentielle Basis für die spezifische pharmakologische Beeinflussung von speicherabhängigen Kanälen zur Behandlung z.B. immunologischer Erkrankungen darstellen.