Kooperatives Gating von CaV1.2

Spannungsabhängige CaV1.2 werden durch Membrandepolarisationen geöffnet. Dabei werden die Spannungssensoren (S4 Segmente) von ihrer Ruheposition (unten) in ihre aktivierte Position (oben) bewegt. Das Schließen der Kanäle wird durch eine Hyperpolarisation initiiert, wobei sich die S4 Segmente in ihre Ruheposition (unten) bewegen und die porenbildenden S6 Segmente in die geschlossene Konformation übergehen. In meinen bisherigen Untersuchungen konnte ich zeigen, dass in CaV1.2 die Neutralisation aller fünf Ladungen des Segments IIS4 kaum Einfluss auf das Öffnungs- und Schließverhalten der Kanäle hat. Dies weist auf eine lose Kopplung zwischen Spannungssensoren und CaV1.2 Pore oder, alternativ, auf eine unbedeutendere Rolle von IIS4 im Vergleich mit anderen S4 Segmenten hin (Beyl et al. 2012). Entweder sind am Öffnungs- und Schließvorgang nicht alle Ladungen der S4 Segmente von CaV1.2 beteiligt oder das Öffnen und/oder Schließen wird vorrangig durch andere S4 Segmente als IIS4 bewerkstelligt. Meine bisherigen Untersuchungen haben außerdem gezeigt, dass Segment IIS4 nicht ausschließlich mit dem Segment der Domäne II (IIS6) wechselwirkt, sondern auch mit S6 Segmenten anderer Domänen (I, III und IV) interagiert. Dies führte zur Hypothese, dass die Transduktion des S4-Signals über kooperative Interaktionen zwischen S6 Segmenten erfolgt (Beyl et al. 2012). Konservierte kleine Aminosäuren (GAGA Ring) scheinen dabei mit größeren benachbarten Aminosäuren zu interagieren (Depil, Beyl et al., 2011). Die molekulare Basis dieses kooperativen Öffnungs/Schließmechanismus ist derzeit unbekannt und Gegenstand des vorliegenden Projektantrages. In den Untersuchungen werden gerichtete Mutagenese, Fluorometrie, biophysikalische Methoden und Homologie-Modeling eingesetzt. Die Rolle von Aminosäureinteraktionen im Schließmechanismus soll durch Punktmutationen in benachbarten S6-Segmenten untersucht werden, wobei bevorzugt die durch Homologiemodelle prognostizierten Interaktionen zwischen den kleinen Aminosäuren des GAGA-Rings und benachbarten bulky Aminosäuren analysiert werden. Systematische Strukturänderungen in den S4-S5 Linkerregionen sollen zum Verständnis des elektromechanischen Kopplungsmechanismus und der Rolle der jeweiligen S4 Segmente beitragen. Die für die Öffnung und Schließung erforderliche Minimalladung der Spannungssensoren (IS4-IVS4) wird durch konsekutives Neutralisieren der geladenen S4 Aminosäuren bestimmt. Einblicke in die potentiell individuellen Beiträge von S4 Segmenten zur Kanalöffung/Schließung sollen durch den Einsatz von fluorometrischen Techniken gewonnen werden. Das gemeinsame Erfassen von fluorometrischer und biophysikalischer Daten (Aktivierung/Deaktivierung) sollklären,wie Konformationsänderungen in S4 Segmenten zu Gatingstrukturen in benachbarten Domänen weitergeleitet werden.

Ein Kalziumeinstrom durch spannungsgesteuerte Kalziumkanäle ist eine unverzichtbare Voraussetzung für viele zelluläre Prozesse. Dies wird durch Kanaltote (gates) gewährleistet, die sich bei Membrandepolarisation öffnen und den Kanal in Ruhe fest verschließen. Dieser Tor-Öffnungsvorgang besteht aus Teilprozessen: der Bewegung der Spannungssensoren (den Kanalsegmenten S4) sowie der eigentlichen Tor-Öffnungs- und Tor-Schließung-Bewegung (engl. Gating) der Porenbildenden S6 Segmente. Die Neutralisierung von geladenen Aminosäuren der S4 Segmente zeigte, dass die Poren-Öffnung durch eine "Freigabe" ("gate-releasing" Bewegung) aller vier S4 Segmente eingeleitet wird, wobei die ("gate-releasing" Bewegungen der Segmente IS4 und IIIS4 geschwindigkeitsbestimmend (rate limiting) sind. Das Segment IS4 spielt zudem eine Schlüsselrolle im Prozess der Kanalinaktivierung. Unsere Untersuchungen konnten interessanterweise zeigen, dass S4 Segmente mit nur einer Ladung effektiv am Gating beteiligt sind. An der Stabilisierung der Kanalpore im offenen Zustand sind jedoch alle S4 Ladungen beteiligt. Biophysikalische (patch clamp) und pharmakologische Untersuchungen, mathematische Simulationen und die Bestimmung von Gating-Parametern, sowie Strukturdaten von Kalziumkanälen aus jüngster Zeit ermöglichten uns die Formulierung eines neuen Gating-Modells für spanungsgesteuerte Kalziumkanäle. Dieses neue Konzept gestattet gleichzeitig eine umfassendere Interpretation von Kanalerkrankungen, besonders für Mutationen im Bereich der Kanalpore und auf den Spannungssensoren.