NanoSIMS/EM/CLSM-Imaging antitumoraler Platinumverbindungen

Platinverbindungen spielen wegen ihres hohen kurativen Potentials in bestimmten Krebserkrankungen eine wichtige Rolle in der Tumortherapie. Die Mechanismen, welche der Wirksamkeit, der Selektivität und den Nebenwirkungen von Platinverbindungen zugrunde liegen, sind jedoch nicht völlig verstanden. Interaktionen mit verschiedenen Zellorganellen können zu diesen Mechanismen beitragen, aber bislang existiert keine Imaging-Technik, welche die Visualisierung sowohl der Wirkstoffverteilung als auch der Ultrastruktur in derselben Zelle ermöglicht. In diesem Projekt soll die Verteilung einer klinisch relevanten Platinverbindung (Oxaliplatin) und zweier experimenteller Platin-Wirkstoffe in zwei- und dreidimensionalen Kulturen maligner und nicht-maligner Zellen sowie in tierischen Normal- und Tumorgeweben dargestellt werden, um jene subzellulären Strukturen zu identifizieren, in welchen die Wirkstoffe angereichert werden. Zu diesem Zweck werden neuartige Kombinationen von hochauflösender Sekundärionen-Massenspektrometrie (NanoSIMS) mit Transmissions- und Raster-Elektronenmikroskopie (TEM, SEM) und konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) zur Anwendung kommen, welche bisher nicht gekannte Möglichkeiten des subzellulären Wirkstoff-Imagings eröffnen. Zu synthetisierende Platinkomplexe, deren Liganden mit stabilen Isotopen markiert sind, werden zur Untersuchung der intrazellulären Dissoziation/Aktivierung sowie der Zusammenhänge zwischen Lokalisation der Wirkstoffe und biologischer Aktivität/Resistenz herangezogen werden, indem die subzelluläre Verteilung sowohl des Platins als auch des zur Markierung verwendeten Isotops analysiert werden. Die Zusammenschau von hoch aufgelösten Wirkstoff-Verteilungsmustern, Zellmorphologie und Ultrastruktur verspricht, Fragen zu Aktivität und Nebenwirkungen der Wirkstoffe sowie zur Resistenz gegen diese Wirkstoffe zu klären. Dieser neue Ansatz soll schließlich von konventionellen einschichtigen Zellkulturen auf multizelluläre Sphäroide und tierische Gewebsproben übertragen werden. Neuartige Probenpräparations-Techniken sollen etabliert und optimiert werden, um die kombinierte Anwendung dreier verschiedener Imaging-Techniken auf dieselben Probenausschnitte zu ermöglichen und um Verteilungs-Artefakte (z.B. Auswaschung und Umverteilung der Analyte durch Entwässerung und Einbettung) zu minimieren. Durch parallele Analysen mit induktiv-gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS) und Elementaranalysator-Isotopenverhältnis- Massenspektrometrie (EA-IRMS) sollen (bislang nicht verfügbare) in ihrer Matrix übereinstimmende Standards für die Kalibrierung der NanoSIMS-Signalintensitäten zur Verfügung gestellt werden, welche eine Voraussetzung für quantitative Analysen mit der (per se semi-quantitativen) NanoSIMS- Technologie darstellen. Die Anwendung dieser Analysetechniken soll auch helfen, die Auswirkungen der Probenpräparation auf die Konzentration des Analyten zu quantifizieren und die Nachweisgrenzen der neuen Imaging-Methode abzuschätzen.

Während die Rolle der DNS als kritisches Zielmolekül klinisch relevanter Platinverbindungen allgemein akzeptiert ist, ist über die Vielfalt möglicher Interaktionen mit anderen zellulären Zielstrukturen weit weniger bekannt. Um die subzelluläre Verteilung ausgewählter, mit stabilen Isotopen markierter platin(II)- und platin(IV)-basierter antitumoraler Wirkstoffe zu untersuchen, wurde eine neue Kombination von Nano-Sekundärionenmassenspektrometrie (NanoSIMS) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ausgearbeitet. Die Anwendung dieser kombinatorischen Technik reicht von konventionell zweidimensional kultivierten Zelllinien und 3D-Kulturen (multizellulären Sphäroiden) bis hin zu Organen behandelter Mäuse. Zu den größten Herausforderungen im Zusammenhang mit der Anwendung der kombinatorischen (Nano)SIMS/TEM-Methodik für die Analyse von Spurenelementen und Isotopen gehört die Probenaufbereitung. Um eine Technik auszuarbeiten, welche sowohl die strukturelle als auch die chemische Integrität der Zellen weitestmöglich zu erhalten erlaubt, wurden adhärente 2D-Zellkulturen hochdruck-gefroren, einer raschen Gefriersubstitution unterzogen und in Kunstharz eingebettet. Diese Methode ermöglichte es, die Verteilung von zweifach isotopenmarkiertem Oxaliplatin in drei humanen Kolonkarzinom-Zelllinien (SW480, HCT116 wt und isogene oxaliplatin-resistente HCT116 oxR) zu bestimmen. Damit wurde erstmals die subzelluläre Verteilung des klinisch etablierten Wirkstoffs Oxaliplatin in Tumorzellen mit der Zell-Ultrastruktur korreliert (Legin et al., eingereichtes Manuskript). Multizelluläre Tumor-Sphäroide sind wichtige 3D-Modellsysteme in vitro, da sie das komplexe Tumor-Mikroenvironment besser wiederspielgeln, und stellen daher eine wertvolle Basis für Experimente im Rahmen der Wirkstoffentwicklung dar. In enger Zusammenarbeit mit dem Institut für Analytische Chemie der Universität Wien wurde eine Anordnung von Laserablation und Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (LA-ICP-MS) auf dem höchsten Stand der Technik für die hochauflösende Elementanalyse multizellulärer Tumor-Sphäroide angewendet (Theiner S. et al., 2017). Um die Eignung unseres kombinatorischen Ansatzes in der In-vivo-Situation zu prüfen, wurden Proben muriner Nieren und Tumoren nach Verabreichung von Platin(IV)- Verbindungen (nicht isotopen-markiertes KP2156 und KP1819) korrelative Analysen durchgeführt. Die räumlichen Platinverteilungsmuster wurden mittels LA-ICP-MS bestimmt und für die Selektion jener Regionen verwendet, die dann auf subzellulärer Skala einer SIMS/TEM-Analyse unterzogen wurden. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass sich die Techniken räumlich aufgelöster Elementanalytik effektiv auf verschiedenen Ebenen kombinieren lassen (Legin et al., 2016).