PAM unterhalb der Beugungsgrenze durch stimulierte Verarmung

Die Photoakustische Mikroskopie (PAM) ist eine Mikroskopietechnik, welche als Grundlage den photoakustischen Effekt verwendet. Der photoakustische Effekt beschreibt die thermoelastische Erzeugung von akustischen Wellen, welche durch Absorption von Photonen entstehen. Unter anderem wird der photoakustische Effekt für die strukturelle, funktionelle und molekulare Bildgebung verwendet. Durch Abrastern der Probe mit einem fokussierten Laserstrahl kann man hierbei Auflösungen im Mikrometerbereich erhalten. Diese Methode nennt man im Englischen optical resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM). Die photoakustischen Signale Ultraschallwellen im MHz Bereich werden mittels piezoelektrischen Detektoren gemessen. In OR-PAM ist die laterale Auflösung durch den Durchmesser des Laserspots beschränkt und daher beugungsbegrenzt. In axialer Richtung wird die Auflösung durch die Bandbreite der Ultraschalldetektion limitiert. Um die axiale und laterale Auflösung von PAM zu verbessern, wurden Techniken basierend auf verschiedenen nicht- linearen Effekten verwendet. Obwohl mittels dieser Techniken bessere Auflösungen erreicht werden können, sind die resultierenden Auflösungen noch immer durch die Größe des Fokus beschränkt. In dem vorgeschlagenen Projekt wollen wir diese Einschränkung durch die Verwendung von Verarmungsmethoden aufheben. Es wurde gezeigt, dass in der optischen Fluoreszenzmikroskopie Auflösungen unterhalb der Beugungsgrenze möglich sind, indem man Techniken wie stimulated emission depletion (STED) verwendet. In der STED-Mikroskopie werden Chromophore mittels eines beugungsbegrenzten Laserfokus angeregt. Ein zweiter Laser löscht die angeregten Moleküle an der Peripherie des Anregungslaserfokus. Dadurch wird die Fluoreszenz auf die Mitte des Laserfokus begrenzt. Das Ziel des Projektes ist es, in der photoakustischen Mikroskopie Verarmungstechniken wie STED einzuführen. Dadurch wird die laterale und axiale Auflösung der photoakustischen Mikroskopie unterhalb der Beugungsgrenze gebracht. Insbesondere sollen im vorgeschlagenen Projekt die Grundlagen der photoakustischen Verarmungsmikroskopie untersucht, geeignete Chromophore gefunden und die Machbarkeit der Methode demonstriert werden. Bei der vorgeschlagenen Methode wird der Ursprungsort des photoakustischen Signals durch die Position des im Außenbereich gelöschten Laserspots bestimmt. Infolgedessen ist keine hohe Bandbreite derUltraschalldetektion nötig. Wir beabsichtigen, ein photoakustisches Mikroskopieverfahren basierend auf sinusförmiger Intensitätsmodulation einer Dauerstrich-Laser- Diode für die Anregung einzuführen. Die resultierenden harmonischen photoakustischen Signale werden dabei mittels einer schmalbandigen Detektionstechnik erfasst. Die Verwendung einer Laserdiode als Anregungsquelle erlaubt den Aufbau eines kompakten Systems bei relativ niedrigen Kosten, welches dennoch ein hohes Signal-zu-Rausch-Verhältnis ermöglicht.

Die photoakustische Mikroskopie ist eine Mikroskopietechnik, welche als Grundlage den photoakustischen Effekt verwendet. Der photoakustische Effekt beschreibt die Erzeugung von akustischen Wellen, welche durch Absorption von Photonen entstehen. Unter anderem wird der photoakustische Effekt für die strukturelle, funktionelle und molekulare Bildgebung verwendet. Durch Abrastern der Probe mit einem fokussierten Laserstrahl kann man hierbei Auflösungen im Mikrometerbereich erhalten. Diese Methode nennt man im Englischen optical resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM). Die photoakustischen Signale Ultraschallwellen im MHz Bereich werden mittels piezoelektrischen Detektoren gemessen. In OR-PAM ist die laterale Auflösung durch den Durchmesser des Laserspots beschränkt und daher durch das sogenannte Abbe-Limit begrenzt. In der optischen Fluoreszenzmikroskopie sind Auflösungen unterhalb dieser Grenze möglich, indem man Techniken wie stimulated emission depletion (STED) verwendet. In der STED-Mikroskopie, dessen Entwicklung 2014 mit dem Nobel Preis für Chemie ausgezeichnet wurde, werden Moleküle mittels fokussierten Laserlichts angeregt. Ein zweiter Laser löscht die angeregten Moleküle an der Peripherie des Anregungslaserfokus. Dadurch wird die Fluoreszenz auf die Mitte des Laserfokus begrenzt und die räumliche Auflösung erhöht. Ziel des Projekts war es, ähnliche Techniken in der photoakustischen Mikroskopie einzuführen, um die Auflösung der Methode zu verbessern. Im Rahmen des Projekts wurde eine neue super-auflösende Methode entwickelt - die sogenannte SMoQ-Mikroskopie (super-auflösende Mikroskopie durch gesättigtes Modulationsquenching). Bei dieser Technik werden ein fokussierter Laserstrahl, dessen Leistung zeitlich moduliert ist, und ein Donut-förmiger Dauerstrichlaserstrahl konfokal über die Probe gerastert. Beide Strahlen werden von Molekülen absorbiert. Ausreichend hohe Intensitäten des Donutstrahls führen zur optischen Sättigung der Moleküle am äußeren Rand der Strahlen, was eine Auflösungserhöhung ermöglicht. Dieses neue bildgebende Verfahren kann in der Fluoreszenzmikroskopie und in der photoakustischen Mikroskopie angewendet werden. Ein multimodales Mikroskop, welches gleichzeitig Fluoreszenz- und photoakustische Signale messen kann, wurde während des Projekts entwickelt und bildete die Grundlage für das SMoQ-Mikroskop. Das entwickelte multimodale Mikroskop verwendet eine Laserdiode als Anregungsquelle, wodurch ein kompaktes System zu relativ niedrigen Kosten ermöglicht wird. Zusätzlich wurde ein neues Verfahren zur Bestimmung der Quantenausbeute, d. H. ein Maß für die Effizienz der Photonenemission von Molekülen, vorgeschlagen.