Analyse von phiC31 Integrase-vermittelter Minizirkel-Bildung

Mehrere Verfahren stehen bereits für kontrollierte genomische Manipulierung (z.B. Polymerase, Restriktionsenzyme, ortsspezifische Rekombinase, Transposase, Zink finger Nuclease, TALENs etc.) zur Verfügung. Ortsspezifische Rekombinationssysteme sind effiziente Mittel um präzise in vivo Manipulierung eukaryotischer Genome auszuführen. Sie werden hauptsächlich in tierischen Systemen verwendet, aber ihre Bedeutung in Pflanzen steigt laufend. Wenn die Erkennungssequenzen der Rekombinase gleich orientiert sind, wird das dazwischen liegende DNA-Fragment entfernt und gleichzeitig ein ringförmiges Molekül hergestellt. Mittels Rekombinase können zirkuläre Konstrukte hergestellt werden, um die Proteinexpression zu steigern und um hohe Mengen unteschiedlicher rekombinanter Proteine zu produzieren. Episomale Moleküle ohne bakterielle Restsequenzen senken das Risiko für epigenetische Veränderungen durch DNA- Methylierung oder Effektorgen-Silencing. Die episomale DNA wird jedoch nach ihre Erstellung durch Rekombination in der Zelle erhalten und wird nicht immer unverzüglich zerstört. Es gibt zur Zeit nur geringe Kenntnisse über ihre in vivo Existenz in Pflanzen. Vorhandene Informationen sind unzureichend und das Schicksal der ringförmigen genomischen Sequenzen ist unklar. Es muss vordringlich geklärtwerden, ob Rekombinationsprodukte in den pflanzlichen Zellen über längere Zeit erhalten bleiben, weil dies zu Konsequenzen bezüglich der Biosicherheit führen kann. Man kann die Möglichkeit nicht ausschliessen, dass Zellen, die sich in Teilung befinden, stabile episomale DNA in ihre Nachkommen weitervererben können. Ein besonderes Interesse liegt andererseits in der Nutzung des Potentials pflanzlicher Rekombinationsprodukte. Die Bildung und Stabilität der ringförmigen episomalen Moleküle und die Überwachung ihrer Transgenexpression ist nötig, um sie eventuell für eine Eröhung der Effektorgenexpression in angewandten Systemen zu etablieren. Zusammenfassend ist festzustellen, daß ein besseres Verständnis über die ortspezifische Rekombination unerlässlich ist. Im Mittelpunkt des Projektes steht die Analyse der durch Rekombinase vermittelte Exzision, wo die phiC31 Integrase die Verfolgung der episomale DNA in Pflanzen ermöglicht. Vorläufige Untersuchungen zeigten, daß nach der phiC31 Integrase vermittelte Rekombination, die entfernte chromosomale Zielsequenz stabil in Gerste bleibt. Die Verfolgung der durch phiC31 vermittelte ortspezifische Sequenzentfernung wird durch molekulare Methoden, beziehungsweise durch Anwendung von fluoreszierenden Reporterproteinen in den zwei ausgewählten Modellorganismen -Arabidopsis thaliana und Gerstekultivar Golden Promise- ausgeführt. Sogar der genaue Zeitpunkt der episomalen DNA Bildung und ihr Vorkommen in den Zellen können durch diese Methoden festgestellt werden. Die Ergebnisse werden wichtige Hinweise für die Anwendung von Rekombinationssystemen und Biosicherheit liefern.

Mehrere Verfahren stehen bereits für kontrollierte genomische Manipulierung (z.B. Polymerase, Restriktionsenzyme, ortsspezifische Rekombinase, Transposase, Zink finger Nuclease, TALENs etc.) zur Verfügung. Ortsspezifische Rekombinationssysteme sind effiziente Mittel um präzise in vivo Manipulierung eukaryotischer Genome auszuführen. Sie werden hauptsächlich in tierischen Systemen verwendet, aber ihre Bedeutung in Pflanzen steigt laufend. Wenn die Erkennungssequenzen der Rekombinase gleich orientiert sind, wird das dazwischen liegende DNA-Fragment entfernt und gleichzeitig ein ringförmiges Molekül hergestellt. Mittels Rekombinase können zirkuläre Konstrukte hergestellt werden, um die Proteinexpression zu steigern und um hohe Mengen unteschiedlicher rekombinanter Proteine zu produzieren. Episomale Moleküle ohne bakterielle Restsequenzen senken das Risiko für epigenetische Veränderungen durch DNA-Methylierung oder Effektorgen-Silencing. Die episomale DNA wird jedoch nach ihre Erstellung durch Rekombination in der Zelle erhalten und wird nicht immer unverzüglich zerstört. Es gibt geringe Kenntnisse Über ihre 'in vivo' Existenz in Pflanzen und das Schicksal der ringförmigen genomischen Sequenzen ist unklar. Es muss vordringlich geklärt werden, ob Rekombinationsprodukte in den pflanzlichen Zellen über längere Zeit erhalten bleiben, weil dies zu Konsequenzen bezüglich der Biosicherheit führen kann. Man kann die Möglichkeit nicht ausschliessen, dass Zellen, die sich in Teilung befinden, stabile episomale DNA in ihre Nachkommen weitervererben können. Ein besonderes Interesse liegt andererseits in der Nutzung des Potentials pflanzlicher Rekombinationsprodukte. Die Bildung und Stabilität der ringförmigen episomalen Moleküle und die Überwachung ihrer Transgenexpression ist nötig, um sie eventuell für eine Eröhung der Effektorgenexpression in angewandten Systemen zu etablieren. Zusammenfassend ist festzustellen, daß ein besseres Verständnis über die ortspezifische Rekombination unerlässlich ist. Im Mittelpunkt des Projektes steht die Analyse der durch Rekombinase vermittelte Exzision, wo die phiC31 Integrase die Verfolgung der episomale DNA in Pflanzen ermöglicht. Die Untersuchungen zeigten, daß nach der phiC31 Integrase vermittelte Rekombination, die entfernte chromosomale Zielsequenz stabil in den zwei ausgewählten Modellorganismen Arabidopsis thaliana und Gerste (Hordeum vilgare) bleibt. Die Verfolgung der durch phiC31 vermittelte ortspezifische Sequenzentfernung wurde durch molekulare Methoden, beziehungsweise durch Anwendung von fluoreszierenden Reporterproteinen ausgeführt. Sogar der Zeitpunkt der episomalen DNA Bildung und ihr Vorkommen in den Zellen wurde durch diese Methoden festgestellt. Die Ergebnisse werden wichtige Hinweise für die Anwendung von Rekombinationssystemen und Biosicherheit liefern.