Molekulare Grundlage der Flavanon 4-Reduktase-Aktivität

Die Dihydroflavonol 4-reduktase (DFR) ist ein Schlüsselenzym in der Flavonoid-Biosynthese und katalysiert die Bildung der Vorstufen für die Biosynthese der Anthocyan-Farbstoffe und der monomeren Flavan-3-ole, die die Grundbausteine der Tannine sind. Neben den Dihydroflavonolen, die die wichtigsten Substrate darstellen, können aber auch Flavanone umgesetzt werden. Letzteres wird als Flavanon-4-Reduktase (FNR) Aktivität bezeichnet. Die beiden Flavonoidklassen unterscheiden sich nur durch eine Hydroxylgruppe an der Position 3 des Heterozyklus. Im vorliegenden Projekt soll auf molekularer Ebene die Fähigkeit der DFR untersucht werden, auch Flavanone statt Dihydroflavonole als Substrate umzusetzen. Der überwiegende Teil der DFRs zeigt eine starke Präferenz gegenüber Dihydroflavonolen. Allerdings konnten wir weitere DFR-Typen identifizieren, die entweder nur Dihydroflavonole oder beide Substrate im gleichen Ausmaß akzeptieren. Im Projekt sollen die drei DFR-Typen mit unterschiedlicher Flavanon/Dihydroflavonol-Akzeptanz charakterisiert und weitere Vertreter der seltenen DFR-Typen in verschiedenen Pflanzen identifiziert werden. Ein SequenzvergleichderdreiTypen zeigte fünf signifikante Unterschiede in der Aminosäuresequenz rund um die mutmaßliche Substratbindungsstelle, die essentiell für die Koordination der Hydroxylgruppe in Position 3 und damit der Fähigkeit/Unfähigkeit Dihydroflavonole/Flavanone zu akzeptieren sein könnten. Im Projekt sollen kinetische Studien mit GST-Tag-gereinigten, rekombinanten DFRs aus verschiedenen Pflanzenarten und Dihydroflavonolen bzw. Flavanonen als Substrat durchgeführt werden. Die Ergebnisse sollen mit den Daten der Sequenzanalyse jener Aminosäurebereiche korreliert werden, die für die Flavanon/Dihydroflavonol-Akzeptanz verantwortlich sein dürften. In einem weiterenSchritt sollen auf Ebeneder Aminosäuresequenz Punktmutationen durchgeführt werden, um die Substrat-Akzeptanz entsprechend der Hypothesen zu verändern. Letztendlich sollen dadurch jene Aminosäuren in der Sequenz bestimmt werden, welche für die Akzeptanz von Dihydroflavonolen und/oder Flavanonen verantwortlich sind. Das genaue Verständnis des ersten Schritts in der Bildung der 3-Deoxyflavonoide kann einen wichtigen Beitrag zur Untersuchung der Biosynthese von 3-Deoxyanthocyanidin- Phytoalexinen und antimikrobiellen Inhaltsstoffen im Allgemeinen leisten, was zu einem besseren Verständnis von Wirt-Pathogen-Beziehungen führt.

Die Dihydroflavonol 4-Reduktase (DFR) ist ein Schlüsselenzym der Flavonoid-Biosynthese und katalysiert die Bildung der Flavan 3,4-diole. Neben den Dihydroflavonolen können auch Flavanone als Substrat dienen (Flavanon 4-Reduktase (FNR) Aktivität). Die Substratspezifität der DFR ist komplex und hat einen wesentlichen Einfluss auf das Flavonoid-Spektrum in Pflanzen. Das Projekt beschäftigte sich mit der DFR auf molekularer Ebene, insbesondere der verschiedenen Substratspezifitäten betreffend (i) der Dihydroflavonole/Flavanone, sowie (ii) des Hydroxylierungsmusters im B-Ring der Mais-DFRs A1 und A1*. In silico-Analysen der mutmaßlichen Substrat-Erkennungsregion der DFRs zusammen mit verschiedenen Kristallstrukturmodellen ermöglichten es uns, spezifische Aminosäuren zu definieren, welche für die Substratspezifität verantwortlich sein könnten. Wir klonierten mehrere DFRs von verschiedenen Pflanzen, exprimierten sie heterolog in E. coli und testeten die Substratspezifität in Enzymtests. Positions-spezifische Mutationen und chimäre DFRs wurden erzeugt, um die Möglichkeit einer Interkonversion zwischen den DFR-Typen zu beurteilen. Betreffend der Dihydroflavonol/Flavanon-Akzeptanz konnte bislang keine klare, wechselseitige Interkonversion zwischen den DFR-Typen erreicht werden. Allerdings konnten Tendenzen ausgemacht werden und damit das Verständnis bezüglich möglicher Interaktionen bei der mutmaßlichen Substratbindungsstelle erweitert werden. Kinetische Daten für die Mais A1 und A1* DFR zeigten eine konträre Substratspezifität betreffend des Hydroxylierungsmusters im B-Ring. Durch positions-spezifische Mutationen konnten wir Aminosäuren definieren, welche für die unterschiedliche Substratspezifität verantwortlich sind. Eine komplette Interkonversion zwischen den beiden DFRs konnte durch die Veränderung von nur 2-3 Aminosäuren erreicht werden. Weiters wurde eine spezifische, qualitative PCR-Methode entwickelt, um eine bestimmte gentechnisch veränderte orange Petunie nachzuweisen, welche die A1 DFR aus Mais enthält und aus einem wissenschaftlichen Züchtungsexperiment aus den 1980er Jahren stammt. Ergebnisse aus dem Projekt können das Verständnis der Interaktionen des Substrat/Protein-Komplexes von DFRs verbessen und eröffnen neue Möglichkeiten für Strategien, um Pflanzen mit verändertem Flavonoid-Spektrum herzustellen, was z.B. bezüglich Blütenfarben, Inhaltsstoffzusammensetzung von pflanzlichen Lebensmitteln und phytopathologischen Aspekten von Bedeutung sein kann.