Funktionelle Interaktionen zwischen EVI1 und atRA in LSCs

Das ecotropic viral integration site 1 (EVI1) Gen kodiert für einen Transkriptionsfaktor, der verschiedene zelluläre Prozesse in Kontext-abhängiger Weise beeinflusst. Neben seinen physiologischen Funktionen wirkt EVI1 als Onkogen bei der akuten myeloischen Leukämie (AML): EVI1 ist bei ~10% der AML-Patienten überexprimiert, und diese aberrante Expression ist mit einem schlechten Ansprechen auf derzeit verwendete Therapieschemata, und in der Folge mit einer kurzen Remissions- und Gesamtüberlebensdauer, assoziiert. All-trans Retinsäure (atRA) ist ein Vitamin A-Derivat, das bei einer Vielzahl biologischer Prozesse wichtige Rollen spielt. atRA beeinflusst die zelluläre Physiologie primär durch Bindung an und Aktivierung von nukleären Rezeptoren, die die Aktivität von Zielgenen durch direkte DNA-Interaktionen steuern. atRA fördert die Ausreifung normaler, aber auch maligner, myeloischer Zellen, und es wird angenommen, dass diese Eigenschaft seiner grossen therapeutischen Wirksamkeit bei der akuten Promyelozytenleukemie (APL),einerdurch funktionsstörende Rearrangements des Retinsäurerezeptorgens charakterisierten Unterform der AML, zugrundeliegt. Kürzlich veröffentlichte Untersuchungen aus dem Labor der Antragstellerin zeigten, dass EVI1 die Effekte von atRA auf Genregulation, Zellzyklusarrest, Differenzierung und Apoptose menschlicher maligner myeloischer Zellen verstärkte. Nichtsdestotrotz konnte, im Unterschied zu der Situation bei der APL, in bisherigen klinischen Studien kein eindeutiger therapeutischer Nutzen von atRA in der Behandlung der non-APL AML, ob mit oder ohne EVI1-Überexpression, nachgewiesen werden. Eine mögliche Erklärung hierfür liegt in der Tatsache, dass atRA zwar die Differenzierung partiell ausgereifter myeloischer Zellen fördert, hingegen die Erhaltung und Vermehrung hämatopoietischer und möglicherweise auch leukämischer Stammzellen (LSCs), also der sich selten teilenden, unreifen, pluripotenten Zellen, die sowohl die normale als auch die maligne Hämatopoiese aufrechterhalten, stimuliert. In den hier vorgeschlagenen Experimenten soll die Interaktion zwischen EVI1 und atRA in Bezug auf die Erhaltung und Vermehrung von AML LSCs untersucht, und mit den Effekten von atRA auf APL LSCs verglichen werden. Dazu werden zwei verschiedene Mausmodelle, in denen AML sowohl in Kombination mit als auch in Abwesenheit von EVI1-Überexpression hervorgerufen werden kann, sowie ein Mausmodell für APL verwendet werden. Die Anzahl, Aktivität, und Proliferation von LSCs wird mit mehreren einander ergänzenden, dem aktuellen Stand des Wissens entsprechenden Assays gemessen werden. Gene, die in synergistischer Weise durch EVI1 und atRA in LSCs reguliert werden, werden mittels "RNA based next generation sequencing" identifiziert werden, und ihr Beitrag zu den gemeinsamen biologischen Effekten von EVI1 und atRA wird untersucht werden. Ein besseres Verständnis der Effekte von atRA auf AML LSCs, und seiner Interaktionen mit EVI1 in diesem Kontext, wird eine Basis für die Interpretation seiner therapeutischen Wirksamkeit bei der non-APL AML darstellen, und könnte zu Adaptationen des Therapieprotokolls führen, die die Realisation eines möglichen therapeutischen Potentials von atRA bei der non-APL AML erlauben.

Hintergrund und Fragestellung: Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine aggressive, trotz intensiver Therapie oft tödlich verlaufende maligne Erkrankung bestimmter Blutzellen. Wie alle Tumorerkrankungen beruht sie auf erworbenen (i.e., nur in den Tumorzellen vorliegenden) Veränderungen des genetischen Materials, bzw. der Aktivität ("Expression") von Genen. Anhand der spezifischen Identität dieser Veränderungen lassen sich Untergruppen der AML definieren, die unterschiedlich auf verschiedene Therapien ansprechen. Eine dieser Untergruppen, die akute Promyelozytenleukämie, spricht sehr gut auf all-trans Retinsäure (atRA) an. atRA ist eine körpereigene Substanz; ihre therapeutische Verabreichung ist mit vergleichsweise geringen Nebenwirkungen verbunden. Trotz intensiver Forschung und teilweise vielversprechenden Daten ist ihr therapeutischer Nutzen in anderen AML-Untergruppen jedoch nach wie vor unklar. Ein Aspekt, der dabei vernachlässigt worden war, ist, dass die AML eine Stammzell-basierte Erkrankung ist, d.h. Tumorentstehung, Therapieresistenz und Rezidivbildung sind auf eine kleine Subpopulation von leukämischen Zellen, die leukämischen Stammzellen (LSZ), zurückzuführen. Um die Wirkung therapeutischer Substanzen zu verstehen, ist es daher notwendig, ihren Effekt auf LSZ zu verstehen. Zu Beginn des gegenständlichen Projekts war der Effekt von atRA auf LSZ nur indirekt in einer einzigen Publikation untersucht worden. Projektziel war es daher, den Effekt von atRA auf AML LSZ zu untersuchen, mit spezifischem Augenmerk auf eine AML-Untergruppe, die durch hohe Expression des EVI1-Gens gekennzeichnet ist. EVI1 spielt eine wichtige Rolle in normalen Blut-Stammzellen. Aberrante EVI1-Expression ("Überexpression") in ~10% der PatientInnen mit AML ist mit einem besonders schlechten Ansprechen auf typische Chemotherapie-Schemata verbunden. Ergebnisse: Es wurde ein Mausmodell verwendet, in dem AML durch Expression von MLL-AF9, eines der bei humaner AML auftretenden aberranten Gene, hervorgerufen wird. Sowohl im Menschen als auch in der Maus kann in MLL-AF9-getriebener AML zusätzlich EVI1 überexprimiert sein oder nicht. In diesem Mausmodell stimulierte atRA LSZ-Aktivität - diese sonst als anti-leukämisch beschriebene Substanz wirkte also in diesem Kontext Leukämie-fördernd. Diese Wirkung war jedoch von der zusätzlichen Expression von Evi1 abhängig; in deren Abwesenheit hatte atRA keinen Effekt auf LSZ. Ein Antagonist (eine Substanz mit entgegengesetzter biologischer Wirkung) hemmte die Aktivität von LSZ aus MLL-AF9-getriebener, Evi1-exprimierender AML, und verlängerte das Überleben von Mäusen mit dieser Erkrankung. Eine umfassende Genexpressionsanalyse an LSZ zeigte, dass EVI1 und atRA auch bezüglich der Regulation von Zielgenen miteinander wechselwirkten. Für zwei dieser Zielgene, Notch4 und Il2ra, wurden wichtige Funktionen bei der Leukämogenese und/oder in LSZ gezeigt. In einem zweiten, durch die veränderten Gene Flt3-ITD und Npm1c getriebenen AML-Mausmodell hemmte atRA LSZ Aktivität, dieser Effekt wurde jedoch durch Überexpression von Evi1 aufgehoben. Schlussfolgerung: atRA kann - abhängig von den vorliegenden AML-spezifischen genetischen Veränderungen bzw. deren Wechselwirkungen - sowohl pro- als auch anti-leukämische Wirkungen auf AML LSZ haben. Diese Komplexität war unerwartet, stellt jedoch einen ersten wichtigen Schritt in Richtung einer "massgeschneiderten" Anwendung von atRA in der AML-Therapie dar ("Präzisionsmedizin").