Identifikation aktivierter Neurone im Mäusegehirn

Unser Ziel ist es, diejenigen neuronalen Netzwerke im Gehirn sichtbar zu machen, die bei der Abspeicherung angstbesetzter Erinnerungen eine Rolle spielen. Diese Prozesse sind beispielsweise bei der Entstehung und Aufrechterhaltung der Posttraumatischen Belastungsstörung von entscheidender Bedeutung. Nach wie vor ist unklar, welche Hirnstrukturen hierin einbezogen sind. Bisherige Untersuchungen beim Menschen verwenden bildgebende Verfahren wie fMRI, ohne dass zelluläre Auflösung erreicht werden könnte. Tierexperimentelle Untersuchungen hingegen, die eine derartig Auflösung gestatten, konzentrieren sich in der Regel auf kleine Hirnteile in der Petrischale. Bisher gibt es keine methodischen Ansätze, die den Nachweiss neuronaler Aktivität auf zellulärer Ebene im gesamten Gehirn gestatten. Eine solche Auflösung kann man erreichen, wenn stark aktivierte Nervenzellen ein fluoreszierendes Protein produzieren und man dieses sichtbar machen kann. Wir wollen gentechnisch veränderte Mäuse verwenden, bei denen genau dies geschieht, um die bei Angst aktiven neuronalen Strukturen zu identifizieren. Dafür sollen nach dem Experiment die Hirne der Mäuse mit Angsterfahrung zunächst mit einem von uns entwickelten chemischen Verfahren durchsichtig gemacht werden. Danach wollen wir die Hirne mit dem von uns entwickelten 3D-Ultramikroskop aufnehmen. Wir hoffen damit, so etwas wie eine Kernspintomographieaufnahme der bei Angst aktiven Strukturen mit zellulärer Auflösung zu erzielen. Die Etablierung dieser Technik würde völlig neue Möglichkeiten zur Untersuchung von Veränderungen im Gehirn durch Emotionen und Verhalten ermöglichen.

Seit einigen Jahren ist eine neue Technologie verfügbar, die es erlaubt, die Hirnanatomie und die Verteilung aktiver Neurone im Mäusegehirn darzustellen: Die Chemische Klärung des Mäusegehirns. Das bedeutet, dass das Gehirn durch Einlegen in eine Serie von Chemikalien durchsichtig gemacht wird. Mit diesen Chemikalien wird zunächst Wasser entzogen, danach werden die Gehirne in ein Gemisch öliger Substanzen gelegt. Jeder kennt den Effekt, wenn ein Tropfen Salatöl auf ein Blatt Papier fällt: An dieser Stelle wird das Papier durchsichtig. Natürlich müssen die Neurone auch mit einer fluoreszierenden Substanz markiert sein um abgebildet werden zu können. Dies ist mit besonders gezüchteten Mäusen möglich, die das fluoreszierende Protein GFP in einer Untergruppe von Neuronen exprimieren. Es gibt auch andere Mäusestämme, die einen rot fluoreszierenden Marker exprimieren, wenn die Neurone stark aktiv sind. Auf diese Weise kann man die Teile des Gehirns und die Neurone visualisieren, die bei einem bestimmten Verhalten oder nach starken Stimuli aktiviert wurden. Um genau die 3D Verteilung der aktivierten Neurone darstellen zu können braucht man eine Bildgebung, die es erlaubt, das komplette Volumen des Mäusegehirns mit Mikrometerauflösung aufzunehmen. Dies ist mit einer besonderen Art von Mikroskopie möglich, der Ultramikroskopie, die wir schon vor Jahren entwickelt haben. Ultramikroskopie meint die Anwendung der Lichtblattmikroskopie auf geklärte Proben. Die durchsichtige und fluoreszierende Probe wird langsam durch das Lichtblatt geschoben, wobei tausende von optischen Schnitten erzeugt werden. Diese optischen Schnitte werden nacheinander mit einer Kamera aufgenommen und schließlich wird ein 3D Bild aus diesen Aufnahmen rekonstruiert. Ein Problem mit diesem Ansatz ist, dass die chemischen Substanzen, die benutzt werden um das Gehirn durchsichtig zu machen, die fluoreszenten Proteine zerstören können, die man aufnehmen will. Ein wichtiger Teil des Projekts war daher die Verbesserung der existierenden Klärtechnologie, sodass das fluoreszente Signal in den aktivierten Neuronen gut erhalten blieb. Ein anderes Problem war, dass man Mikroskopobjektive mit guter Auflösung und grossem Bildfeld braucht um ein ganzes Mäusegehirn auf einmal aufzunehmen. Es musste auch möglich sein, diese Objektive in die Klärflüssigkeit einzutauchen, um ein gutes Bild zu bekommen. Dies war mit den existierenden Luftobjektiven kleiner Vergrösserung nicht möglich, sodass wir sie modifizieren mussten. Ein anderer wesentlicher Punkt war die Auflösung des Mikroskops. Oft ist die Auflösung von Mikroskopen in lateraler Richtung sehr viel besser als in axialer. In der Ultramikroskopie hängt die axiale Auflösung von der Dicke des verwendeten Lichtblatts ab. Lichtblätter, die mit Standardoptik erzeugt werden, sind in der Mitte dünner als am Rand, sodass die Seiten der erzeugten Bilder verschwommen erscheinen. Deshalb haben wir erhebliche Anstrengungen unternommen, um mit Spezialoptik möglichst gleichmässige Lichblätter zu erzeugen. Mit all diesen technischen Entwicklungen waren wir schliesslich in der Lage, Subpopulationen von Neuronen in bestimmten Bereichen des Mäusehirns aufzunehmen, die bei Stressreaktionen der Maus aktiv sind.