MORDOR-Modifizierte mRNAs als dyn. Operatoren von Ribosomen

Die Proteinsynthese ist ein zentraler Prozess in jeder lebenden Zelle. Der Hauptakteur dieses komplexen Vorganges ist das Ribosom. Dieses besteht aus mehr als 60 verschiedenen RNAs und Proteinen und ermöglicht die schnelle und annähernd fehlerfreie Synthese von Peptiden und Proteinen. Das Ribosom verwendet als Bauplan für die Synthese eine temporäre Kopie eines Abschnittes des Genoms, die sogenannte messenger RNA (mRNA). Da der Prozess der Translation ungefähr 40% der Energieressourcen einer Zelle verbraucht, ist ein effizienter Ablauf essentiell. Infolgedessen unterliegt fast jeder Schritt der Proteinsynthese einer genauen Regulation. Eine Möglichkeit die Translation zu steuern, ist die chemische Modifikation der mRNA. In vielen Organismen werden einzelne Nukleotide der mRNA durch verschiedene Enzyme chemisch verändert. Es konnte gezeigt werden, dass diese Veränderungen die Stabilität, Prozessierung und die Lokalisation dieser mRNAs beeinflussen und damit auch indirekt die Proteinsynthese. Bisher wurden 4 Arten derartiger Modifikationen in den zu translatierenden Bereichen der mRNA nachgewiesen. Über deren direkte Auswirkung auf die Translation gibt es bisher nur wenige und überdies widersprüchliche Untersuchungsergebnisse. Ferner wird in verschiedenen Publikationen darüber spekuliert, ob bestimmte Modifikationen den genetischen Code verändern können. In unserem Projekt wollen wir systematisch den Einfluss von chemischen Modifikationen auf das Ribosom in einem definierten System untersuchen. Unser Ziel ist es herauszufinden, welche Modifikationen den Translationsapparat bremsen oder gar blockieren können und welche vielleicht sogar den genetischen Code verändern. Unsere Herangehensweise beruht auf ein möglichst definiertes System, welches durch kleine Adaptionen vielseitig eingesetzt werden kann. Die Basis ist eine mRNA, in welcher wir nur an definierten Positionen Modifikation einbauen. Diese mRNA wird in einem in vitro System translatiert und das Proteinprodukt auf seine Quantität und Qualität überprüft. Diese beiden Kriterien können mittels etablierten Methoden wie Gelelektrophorese und Massenspektrometrie untersucht und bestimmt werden. Dieser experimentelle Ansatz kann auch mit wenigen Abänderungen schnell auf unterschiedliche Systeme von verschiedenen Organismen angewandt werden. Ein Vergleich von verschiedenen Organismen bringt nicht nur neue Erkenntnisse über die generelle Funktion von Modifikationen in mRNAs, sondern kann auch Unterschiede in den Mechanismen der Proteinsynthese aufzeigen. Es ist auch durchaus möglich, dass sogar innerhalb eines Organismus verschiedene Zelltypen und Gewebe unterschiedlich auf mRNA Modifikationen reagieren. Dies würde nicht nur zu einem erheblichen Erkenntnisgewinn beitragen, sondern auch Möglichkeiten zur Entwicklung neuer Methoden schaffen um die Genexpression einzelner Zelltypen zu beeinflussen. Langfristig könnte dies auch die Strategie in der Entwicklung von Medikamenten gegen bestimmte Organismen oder Zellen beeinflussen.

Das Ribosom ist die Proteinfabrik der Zelle, die aufgrund des genetischen Bauplans alle Proteine schnell und korrekt produzieren muss. Dieser Prozess beinhaltet die Übersetzung des genetischen Codes bestehend aus 4 Nukleotiden in eine Aminosäurensequenz, welche aus 20 (21) verschiedenen Bausteinen besteht. Damit dieser Prozess funktionieren kann, braucht es zusätzlich zur mRNA (die den Bauplan beinhaltet) und dem Ribosom (der Fabrik) auch noch Transfer-RNAs (tRNA), die als Adapter fungieren. Ein entscheidender Aspekt der Translation ist das richtige und schnelle Erkennen der richtigen tRNAs, die mit der entsprechenden Aminosäure beladen sind. Das Ribosom muss aus 40-50 verschiedenen beladenen tRNAs die passende erkennen und diese dann binden. Dieses sogenannte Dekodieren der tRNAs, basiert auf definierten Interaktionen der mRNA Codons und der tRNA Anticodons. Diese Interaktionen werden aus Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basen von Adenosin/Uracil und Guanosin/Cytosin gebildet. In den letzten Jahren wurde der Begriff des Epitranskriptoms geprägt, da mehr und mehr modifizierte Nukleotide in mRNAs identifiziert wurden, welche als potentielle Regulatoren der Genexpression fungieren könnten. Solche Nukleotidderivate wurden auch in den kodierenden Bereichen der mRNAs gefunden, welche das dekodieren der mRNA beeinflussen. In diesem Projekt haben wir systematisch verschiedene modifizierte Nukleotide in die mRNA eingebracht und deren Einfluss auf das Dekodieren getestet. Wir haben die Effizient als auch die Genauigkeit der Translation untersucht und festgestellt, dass diverse Modifikationen eine breite Bandbreite an Auswirkungen haben können. In weiteren Projekten haben wir zusätzlich noch nicht natürliche Modifikationen in verschiedene Bereiche der mRNA eingebracht um Interaktionen zwischen mRNAs und tRNAs oder Proteinen zu manipulieren. Diese Untersuchungen ermöglichten eine detaillierte Identifikation von einzelnen Interaktionen, die sowohl für das Dekodieren als auch für die Termination der Translation wichtig sind. Wir konnten minimale Sets an Interaktionen definieren und auch die Bedeutung einzelner Wasserstoffrücken herausarbeiten. Die Resultate dieser Studien ermöglichten detailliertere Einblicke in die Funktionsweise des Ribosoms.