Crc in Hfq abhängiger Katabolitrepression in P. aeruginosa

Die bevorzugte Aufnahme und Metabolisierung von energiereicheren, gegenüber weniger energiereichen Kohlenstoffquellen wird in Bakterien durch einen Mechanismus kontrolliert, der als Katabolit-Repression (KR) bezeichnet wird. Im Unterschied zu anderen Bakterien findet dies in Pseudomonas auf post-transkriptionaler Ebene statt, wobei das RNA-Bindeprotein Hfq hierbei als translationaler Repressor für katabolische Gene fungiert, deren Funktionen für die Metabolisierung von energiearmen Kohlenstoffquellen benötigt werden. Nach Verbrauch von energiereichen Kohlenstoffquellen kann die Synthese dieser katabolischen Enzyme dadurch angeschaltet werden, dass die regulatorische RNA CrcZ an Hfq bindet und damit den Regulator inaktiviert. Zusätzlich bestehen mehrere Hinweise, dass das Pseudomonas Katabolit-Repressions-Kontrollprotein Crc als Co-Regulator von Hfq fungiert. Das Ziel dieser Arbeit ist diese Interaktion zwischen Hfq und Crc durch genetische, biochemische und biophysikalische Methoden auf molekularer Ebene zu untersuchen. Derzeit ist kein Protein bekannt, von dem gezeigt wurde, dass es die Funktionsweise von Hfq beeinflusst. Die projektierten Arbeiten haben daher auf der einen Seite das Potential einen neuen Mechanismus in der Hfq bedingten Regulation zu entschlüsseln, nämlich dass die Funktionsweise von Hfq selbst durch andere Proteine moduliert werden kann. Andererseits wurde gezeigt, dass Hfq und Crc die Antibiotikaresistenz-, sowie die Biofilmbildung in P. aeruginosa beeinflussen. Diese Untersuchungen sollten daher weiters zu einem besseren Verständnis der metabolischen Regulation der Antibiotikaresistenzbildung und Biofilmentwicklung beitragen, wodurch sich neue Strategien für die therapeutische Intervention ergeben können.

Hintergrund: Die Pathogenizität des opportunistischen human-pathogenen Bakteriums Pseudomonas aeruginosa beruht auf einer Kombination von verschiedenen Virulenzfaktoren, der Fähigkeit Biofilme zu bilden, einer zunehmenden Resistenz gegenüber Antibiotika und auf der Fähigkeit eine Vielzahl von Substraten verwerten zu können. In Bakterien wird die Aufnahme und Verwertung von Kohlenstoffquellen im Rahmen der Katabolitrepression reguliert. Diese bewirkt, dass energiereiche Verbindungen bevorzugt verwertet werden. Im Gegensatz zu anderen Bakteriengruppen erfolgt diese Regulation in P. aeruginosa post-transkriptional. Zu Beginn dieser Studien war bekannt, dass der globale Regulator Hfq durch Bindung im Bereich der Ribosomenbindungstelle als translationaler Repressor für mRNAs fungiert, die für Proteine kodieren, die an der Aufnahme oder am Abbau von weniger energiereichen Verbindungen beteiligt sind. Ebenso ergaben unsere vorangegangenen Studien, dass das Protein Crc die Hfq-mediierte translationale Repression verstärkt. Ein Hauptziel dieser Studie war die Aufklärung des molekularen Mechanismus der Crc Funktion. Da sowohl für Hfq als auch für Crc ein Einfluss auf die Antibiotikaempfindlichkeit von P. aeruginosa nachgewiesen wurde, war weiters zu erwarten, dass diese Studien auch neue Einsichten in diese Prozesse erlauben. Ergebnisse: Unsere biochemischen und biophysikalischen Studien ergaben, dass die Hfq/Crc Interaktion nur in Gegenwart eines (m)RNA Substrates für Hfq stattfindet. In dem Hfq/Crc/RNA Komplex interagiert Crc sowohl mit Hfq, als auch mit RNA. Durch Verwendung eines Einzelmolekül-Fluoreszenz-Verfahrens konnten wir zeigen, dass Crc weder die Affinität von Hfq für ein RNA Substrat noch die Stabilität eines Hfq-RNA Komplexes direkt beeinflusst, sondern dass die Gegenwart von Crc das Equilibrium in Richtung stabilere Hfq/Crc/RNA Komplexe verschiebt. Diese biophysikalischen Ergebnisse stehen im Einklang mit Cryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM) Studien, die zeigten, dass Hfq/Crc/RNA Komplexe kompakter sind als Hfq/RNA Komplexe. Weiterführende Cryo-EM Studien erlaubten erstmals Einblicke hinsichtlich der Assemblierungsschritte von Hfq/Crc an verschiedenen RNAs und der RNA Charakteristika, die für diese Assemblierung notwendig sind. Zusammenfassend ermöglichten diese Studien einerseits Einblicke, wie ein Protein (Crc) die Funktion des globalen Regulators Hfq modulieren kann und andererseits wie Hfq und Crc die Variabilität der Quaternärstruktur dieser "repressiven Komplexe" beeinflussen, d.h. wie diese Proteine dazu beitragen größere RNA Segmente in eine kompakte translational repressive Struktur zu falten. Im Rahmen unserer Studien haben wir einen neuen Faktor, PA1677, identifiziert, der an Crc bindet und vermutlich dazu führt, dass Crc nach Beendigung der Katabolitrepression die Formation von Hfq und Crc an katabolischen Genen verhindert, deren Expression für die Verwertung nicht bevorzugter Kohlenstoffquellen notwendig ist. Biochemische und Cryo-EM Studien konnten erklären, warum Crc die Bindung von kleinen regulatorischen RNAs an Hfq und damit die Riboregulation verhindert. Folglich priorisiert Crc die Funktion von Hfq hinsichtlich einer optimalen Kohlenstoffverwertung. Die Porenproteine OprD und OpdP dienen als Eintrittspforten für Carbapenem Antibiotika. Wir konnten zeigen, dass ein Hfq/Crc Komplex die Translation von opdP mRNA translational inhibiert. Diese Studien ergaben neue Erkenntnisse zur Katabolitrepression-gesteuerten Antibiotikaempfindlichkeit.