Sprouty2 und Rezeptor-Tyrosinkinase Trafficking

Rezeptor-Tyrosinkinasen in der Zellmembran leiten die Signale aus der Umgebung ins Innere der Zelle weiter und steuern so viele Vorgänge wie die Zellteilung oder die Regeneration von Nerven. Deshalb spielen diese Signale bei Tumorerkrankungen wie Gliomen des Gehirns sowie nach Verletzungen von Nerven eine wichtige Rolle. Ein wichtiger Signalweg von Rezeptor-Tyrosinkinasen ist die Extracellular Signal-Regulated Kinase (ERK). Die Rezeptoren werden nach der Aktivierung an der Zellmembran internalisiert und innerhalb der Zelle weitertransportiert. Dieses sogenannte Trafficking beeinflusst die Aktivität der Rezeptoren und die zellulären Signale. Die Sprouty Proteine beeinflussen die Signalwege verschiedener Rezeptoren und ihre Wirkung kann je nach Rezeptor unterschiedlich sein. So hemmen die Sprouty Proteine etwa die Aktivierung des ERK Signalweges durch den Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor(FGFR) oder den Nerven-Wachstumsfaktor- Rezeptor (TrkA), während sie die ERK Signale durch den epidermalen Wachstumsfaktor- Rezeptor (EGFR) verstärken. Außerdem beeinflusst Sprouty2 das Trafficking und den Abbau des EGFR. Unsere vorläufigen Daten von U373 Gliomzellen zeigen erstmalig, dass Sprouty2 auch einen Einfluss auf das Trafficking und den Abbau des FGFR1 hat. Die Hemmung von Sprouty2 steigert die Zellteilung von U373 Zellen und fördert das Recycling des FGFR1 zurück zur Zellmembran. Das verstärkte Recycling des FGFR1 steigert die Zellteilung von Tumorzellen, fördert aber das Längenwachstum der Axone von Nervenzellen und damit die Regeneration von Nerven. Im Gegensatz dazu erhöht die verminderte Internalisierung des FGFR1 von der Zellmembran die Anzahl der Verzweigungen von Axonen und hemmt dadurch die Nervenregeneration. Nervenzellen von Mäusen mit einem reduzierten Gehalt an Sprouty2 zeigen ein verstärktes Axonwachstum mitdeutlichem Längenwachstum. Nervenzellen denen Sprouty2 gänzlich fehlt hingegen bilden verstärkt Verzeigungen der Axone. Zusätzlich konnte eine Erhöhung des TrkA Rezeptors in Nervenzellen denen Sprouty2 fehlt beobachtet werden. Deshalb ist es das Ziel des vorliegenden Projekts, die Effekte von Sprouty2 auf das Trafficking von FGFR1 und TrkA in Nervenzellen und von FGFR1 und EGFR in U373 Gliomzellen zu untersuchen. Mitdiesen beidenwichtigenModellsystemenfür Nervenregeneration und Tumorwachstum werden wir bestimmen wie eine Änderung der Menge an Sprouty2 das Trafficking des FGFR1 im Vergleich zum EGFR und TrkA in der Zelle beeinflusst. Ziel dieser Arbeit ist es somit die grundlegenden Mechanismen von Sprouty2 auf verschiedene Rezeptorenaufzuklärenund die Bedeutung für die Tumorbehandlung und die Regeneration von Nerven zu untersuchen.

Sprouty Proteine sind im Laufe der Evolution konservierte Regulatoren von intrazellulären Signalwegen die eine wichtige Rolle während der Entwicklung und beim Tumorwachstum spielen. Vier verschiedene Sprouty Isoformen wurden beim Menschen identifiziert. Sprouty2 ist ein Tumorsuppressor der das Wachstum der meisten Krebsarten hemmt aber es ist gleichzeitig ein Onkogen bei bösartigen Hirntumoren wo es das Tumorwachstum fördert. Intrazelluläre Signalwege werden von Wachstumsfaktoren wie dem Epidermalen Wachstumsfaktor oder den Fibroblasten-Wachstumsfaktoren induziert, die Rezeptor-Tyrosinkinasen an der Zelloberfläche aktivieren. Der Epidermale Wachstumsfaktor und die Fibroblasten-Wachstumsfaktoren spielen auch eine wichtige Rolle bei Hirntumoren. Sprouty2 fördert den Signalweg des Epidermalen Wachstumsfaktors weil es den Abbau des Epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors hemmt. Im Gegensatz dazu hemmt Sprouty2 den Signalweg des Fibroblasten-Wachstumsfaktors aber der Effekt von Sprouty2 auf den Abbau von Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptoren war bisher nicht bekannt. Deshalb haben wir in diesem Projekt den Effekt von Sprouty2 auf den Abbau des Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptors 1 in zwei Zelllinien von bösartigen Gehirntumoren des Menschen mit niedrigem (U251) und hohem (SF126) Sprouty2 Gehalt untersucht. Wir haben gezeigt, dass Sprouty2 den Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 1 durch erhöhte Ubiquitinierung reduziert. Ubiquitin ist ein kleines Protein das Rezeptor-Tyrosinkinasen für den Abbau im Lysosom markiert, und die Degradation des Rezeptors hemmt die intrazellulären Signalwege. Die Aktivierung der Phospholipase C gamma 1 durch den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 wurde von Sprouty2 in beiden Zelltypen gehemmt während die Aktivierung der Extracellular Signal-regulated Kinase nur in U251 Zellen vermindert war. Im Gegensatz dazu war die Menge des Epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors durch Sprouty2 erhöht. Deshalb wurde die Aktivierung der Phospholipase C gamma 1 durch den Epidermalen Wachstumsfaktor von Sprouty2 in beiden Zelltypen gesteigert aber die Aktivierung der Extracellular Signal-regulated Kinase nur in SF126 Zellen. Zusätzlich hemmte Sprouty2 die Endozytose des Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptors 1. Nach der Aktivierung durch Wachstumsfaktoren werden die Rezeptoren an der Zelloberfläche durch Endozytose ins Innere der Zelle verlagert. Clathrin und Caveolin sind an der Endozytose des Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptors 1 beteiligt, und Sprouty2 hemmte die Clathrin- und Caveolin-vermittelte Endozytose. Die Anzahl der Caveolin-1 Vesikel, die Aufnahme von zugesetztem Transferrin und die Kolokalisation von Transferrin mit dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 1 war durch Sprouty2 vermindert. Transferrin wird von den Zellen durch Clathrin aufgenommen und dann zurück zur Plasmamembran transportiert. Zusätzlich verminderte Sprouty2 die Menge des Zelladhäsionsmoleküls N-Cadherin, welches an Endozytose, Ubiquitinierung und dem Abbau des Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptors 1 beteiligt ist. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse eine neue Funktion von Sprouty2 beim Abbau und der Endozytose des Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptors 1. Sprouty2 hemmt die Endozytose des Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptors 1 und vermindert die Menge an Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 1 durch verstärkte Ubiquitinierung und Degradation. Das hemmt die Aktivierung der Phospholipase C gamma 1 mehr als die Aktivierung der Extracellular Signal-regulated Kinase.