Transfer von miRNA aus einem HDL Partikel auf Zellen

Bis vor kurzem war man der Meinung, dass die Kommunikation zwischen Geweben ausschließlich über Botenstoffe wie Hormone geführt wird. Nun wird es aber immer klarer, dass diese Kommunikation viel komplexer ist und über eine Vielzahl von Kanälen geführt wird. Erst kürzlich wurde ein weiterer Signaltransduktionsweg entdeckt, der sich kurzer RNA Stücken bedient, sogenannter Micro-RNA (miRNA). Diese zirkuliert im Blut und spielt in der Regulation von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen wie Atherosklerose eine Rolle. Folge dessen, wird miRNA auch als diagnostischer Marker diskutiert. Ein Teil der im Blutkreislauf vorhandenen miRNA verwendet das High-Density-Lipoprotein (HDL) als Transportvehikel. Die genauen Details des miRNA Transfers vom HDL zu ihrer Zielzelle sind noch weitgehend unerforscht. Ziel dieses Projektes ist es die Transportprozesse und Transferwege von miRNA aus ihrem Transportvehikel, dem HDL Partikel, in die Zelle zu charakterisieren. Vorhergehende Untersuchungen lassen uns vermuten, dass dieser Transport dem Transfer von Lipiden aus dem HDL Partikel ähnelt. Hochauflösende Mikroskopie-Techniken sollen eingesetzt werden, um an verschiedenen Biomembranen zeitliche Veränderungen auf Nanoebene im Zuge des fortschreitenden Aufnahmeprozesses zu verfolgen. Dafür werden die unterschiedlichen Komponenten des HDL Partikel Fluoreszenz-markiert. Die gleichzeitige Aufnahme der unterschiedlich-gefärbten Fluorophoren, als Marker für die miRNA, für die Lipide und für den HDL Partikel selbst, gibt uns die Möglichkeit den Aufnahme Weg über die Zellmembran in die Zelle hinein zu skizzieren und zeitliche Trennungen zu bestimmen. Mithilfe der Atomkraftmikroskopie (AFM) können über das kovalent gebundene HDL Partikel einzelne miRNA, Cholesterol oder Phospholipide ausgetauscht werden. Hierfür wird die AFM Spitze als eine Art Nanopipette verwendet, um einzelne Moleküle räumlich und zeitlich kontrolliert zu transferieren. Deren fluoreszierendes Signal wird über das Einzelmolekülmikroskop visualisiert. Dafür benötigt es den Zusammenschluss von mehreren Fachrichtungen: die biophysikalischen Methoden werden durch die Gruppe von Fr. Dr. Plochberger, FH OÖ-Campus Linz, und die miRNA Techniken durch unseren internationalen Kollaboration Partner Fr. Dr. Tabet, Univ. of South Wales-Sydney, eingebracht. Die Gruppe von Dr Stangl ergänzt das Projektteam durch die langjährige Erfahrung im HDL-Metabolismus bzw. Lipid Transport sowie der Photooxidation. Im Generellen erlauben die Techniken und Erfahrungen, die durch das Projektteam eingebracht werden, eine Analyse der zellulären Aufnahme von miRNA aus einem HDL Partikel und in weiterer Folge ihrem intrazellulären Transport mit einer Auflösung im Nanometer-Bereich.

Das High Density Lipoprotein (HDL) - das sogenannte "gute" Cholesterin - transportiert neben Lipiden im Blut auch eine Vielzahl von anderen Stoffen, unter anderem verschiedene micro RNAs (miRNAs), die als Botenstoffe Stoffwechselvorgänge abschalten können. HDL kann durch seine positiven Effekte Arterienverkalkung verlangsamen. Durch unsere Ernährungsgewohnheiten, durch Krankheiten und durch das Altern der Partikel selbst können diese in ihrer Funktion abgeschwächt werden. Daher ist es sehr wichtig, die unterschiedlichen HDL Partikel genau zu charakterisieren. Im abgeschlossenen Projekt haben wir die Gesamtheit der zirkulierenden miRNA, sowohl im Blut wie auch im HDL, analysiert. Bei Patienten mit Nierenversagen konnten wir starke Änderungen in Gehalt und Zusammensetzung der miRNA feststellen. Diese Veränderungen könnten mit verantwortlich sein, dass Patienten mit Nierenversagen ein stark erhöhtes Risiko für Arterienverkalkung aufweisen. In weiterer Folge haben wir den Transfer der Fracht, wie zum Beispiel Cholesterin, von HDL auf Membranen mit Hilfe von hochauflösenden mikroskopischen Methoden analysiert. Zuerst wurde die Interaktion von HDL mit einfachen synthetischen Membranen, sogenannten Bilayers, mit Hilfe von Atomkraftspektroskopie untersucht. Diese Methode ermöglicht es, mit einer sehr, sehr feinen Spitze, die Oberfläche schnell abzutasten. Dadurch kann ein dreidimensionales Bild generiert werden. Mit dieser Methode konnten wir einen Einbau des HDL in den Bilayer nachweisen. Gleichzeitig mit dem Einbau erfolgt der Transfer der Fracht, in unserem Fall fluoreszierendes Cholesterin, welches sich danach frei in dieser synthetischen Membrane bewegt. Interessanter Weise zeigt auch das sogenannte "schlechte" Cholesterin -das Low Density Lipoprotein (LDL) dasselbe Muster. Dieser Übertrag konnte auch auf Zellen beobachtet werden, wobei das für die Bindung an die Membran notwendige Protein, genannt Scavenger Receptor Class B Type 1 (SR-B1), durch einen künstlichen "Rezeptor" ersetzt werden konnte.