Chalcon 3-hydroxylase

Das Projekt Chalcon 3-hydroxylase beschäftigt sich mit einem wichtigen Enzym in der Biosynthese von anthochloren Pigmenten (Chalcone und Aurone), die für die gelbe Blütenfärbung und für die Ausprägung von Blütenmalen in Korbblütler-Arten verantwortlich sind und auch gesundheitsfördernde Wirkungen beim Menschen aufweisen. Zudem stellen Chalcone die unmittelbaren Vorstufen für die Bildung der Flavonoide dar, die wichtige Bestandteile der menschlichen Nahrung sind. Aber auch einige pflanzliche Abwehrstoffe auf Isoflavonoidbasis werden ausgehend von den Chalconen gebildet. Die Chalcone 3-hydroxylase (CH3H) gehört zu der bedeutenden Klasse der Cytochrom P450 abhängigen Enzyme und katalysiert die Einführung einer Hydroxylgruppe an der Position 3 von Chalconen. Die Reaktion weist große Ähnlichkeit mit der Hydroxylierung von Flavonoiden an der Position 3 auf, kann jedoch von der bekannten Flavonoid 3-hydroxylase (F3H) trotz ihrer breiten Substratspezifität nicht katalysiert werden. In einem Vorprojekt wurden die Unterschiede in den Enzymstrukturen der CH3H und der F3H, die für die unterschiedliche Funktion verantwortlich sind, untersucht. Es konnte gezeigt werden, welche Regionen einen entscheidenden Einfluss haben, jedoch war eine vollständige Erklärung der beobachteten Effekte ohne eine detaillierte Kristallstruktur nicht möglich. Das neue Projekt hat zum Ziel, die Kristallstruktur der CH3H aufzuklären und die Aktivitäts-bestimmenden Strukturunterschiede zu identifizieren. Zunächst wird die optimale Technik erarbeitet um eine lösliche Form des Proteins in großen Mengen aufzureinigen. Danach sollen Kristallisationsansätze durchgeführt, die dreidimensionale Struktur des Enzyms ermittelt, und die für die Aktivität entscheidenden Aminosäuren identifiziert werden. Durch gezielte Mutationen soll die entscheidende Funktion dieser Aminosäuren bestätigt werden. Das Projekt wird die erste Kristallstruktur eines Cytochrom P450 abhängigen Enzyms der Flavonoidbiosynthese erstellen und damit ein besseres Verständnis der Funktion der CH3H und weiterer nahe verwandter Enzyme dieses wichtigen Biosynthesewegs ermöglichen. Mit diesem Wissen können in Zukunft widerstandsfähigere, attraktivere und gesundheitsförderndere Pflanzen gezüchtet werden.

Das Projekt 'Chalcon 3-hydroxylase' beschäftigte sich mit einem wichtigen Enzym in der Biosynthese von anthochloren Pigmenten (Chalcone und Aurone), die für die gelbe Blütenfärbung und für die Ausprägung von Blütenmalen in Korbblütler-Arten verantwortlich sind und auch gesundheitsfördernde Wirkungen beim Menschen aufweisen. Zudem stellen Chalcone die unmittelbaren Vorstufen für die Bildung der Flavonoide dar, die wichtige Bestandteile der menschlichen Nahrung sind. Aber auch einige pflanzliche Abwehrstoffe auf Isoflavonoidbasis werden ausgehend von den Chalconen gebildet. Die Chalcone 3-hydroxylase (CH3H) gehört zu der bedeutenden Klasse der Cytochrom P450 abhängigen Enzyme und katalysiert die Einführung einer Hydroxylgruppe an der Position 3 von Chalconen. Die Reaktion weist große Ähnlichkeit mit der Hydroxylierung von Flavonoiden an der Position 3' auf, kann jedoch von der bekannten Flavonoid 3'-hydroxylase (F3'H) trotz ihrer breiten Substratspezifität nicht katalysiert werden. In einem Vorprojekt wurden die Unterschiede in den Enzymstrukturen der CH3H und der F3'H, die für die unterschiedliche Funktion verantwortlich sind, untersucht. Es konnte gezeigt werden, welche Regionen einen entscheidenden Einfluss haben, jedoch war eine vollständige Erklärung der beobachteten Effekte ohne eine detaillierte Kristallstruktur nicht möglich. Das neue Projekt hatte zum Ziel, die Kristallstruktur der CH3H aufzuklären und die Aktivitäts-bestimmenden Strukturunterschiede zu identifizieren. Eine Reihe von Herausforderungen bei der Produktion des Enzyms im mg Maßstab wurde erfolgreich überwunden (z. B. unzureichende Hämbelegung, Bildung von Oligomeren und inhomogenem Protein), die mehr Zeit für die Aufklärung der Kristallstruktur benötigten als ursprünglich angenommen. Um eine reibungslose Fortsetzung der Forschung und den erfolgreichen Abschluss der Abschlussarbeiten der 2 beteiligten Doktoranden zu gewährleisten, wurde Folgeprojekt eingereicht und bewilligt. Im Rahmen des projekts haben wir erfolgreich die Methode für die Produktion in großem Maßstab in E. coli und die mehrstufige Reinigung einer modifizierten, löslichen CH3H-Variante mit voller Hämbelegung etabliert und gleichzeitig eine vielversprechende Strategie für die Produktion der natürlich vorkommenden Variante in großem Maßstab membrangebundenes CH3H in Pichia pastoris mit anschließender Reinigung und Screening auf geeignete Kristallisationsbedingungen ist nahezu abgeschlossen. Darüber wurden signifikante Fortschritte bei der Identifizierung von Aminosäuren erzielt, die für die CH3H-, F3'5'H- und F3'H-Aktivität relevant sind.