Analyse und Inhibition der genregulatorischen Rolle von CDK6

Der Antrag Analyse und Inhibition der genregulatorischen Rolle von CDK6 beschreibt einen multidisziplinären Ansatz mit dem Ziel, die Rolle der Cyclin-abhängigen Kinase 6 (CDK6) in der leukämischen Genregulation zu beschreiben. Anfänglich wurde CDK6, so wie das eng verwandte Homolog CDK4, hauptsächlich im Kontext des Zellzyklus studiert. Aberrante Zellzyklus-Regulation führt in weiterer Folge oftmals zu abnormalem Zellwachstum und damit zur Krebsentstehung. Dahingehend wurden pharmakologische Wirkstoffe entwickelt, die diese speziellen Funktionen von CDK4 und CDK6 blockieren. Diese Wirkstoffe sind erfolgreich in verschiedenen Krebsformen getestet worden und erhielten vor kurzem die klinische Zulassung. In jüngerer Vergangenheit wurde CDK6 noch eine zweite Funktion in der direkten Regulation der Genaktivität zugeschrieben. Interessanterweise ist diese Funktion spezifisch für CDK6 und konnte nicht für CDK4 nachgewiesen werden. Unter anderem ist CDK6 in der Aufrechterhaltung von genregulatorischen Netzwerken in verschiedenen Leukämien und leukämischen Stammzellen involviert. Dahingehend würde eine pharmakologische Blockade dieser genregulatorischen Funktion von CDK6 neue therapeutische Möglichkeiten in der Behandlung der abnormalen leukämischen Genaktivität bieten. Allerdings kann man diese genregulatorische Rolle von CDK6, im Gegensatz zur Rolle in der Zellzyklus-Regulation, nicht mit den existierenden Wirkstoffen blockieren. Dies erklärt sich durch die Tatsache, dass CDK6 die Genaktivität nicht via der enzymatischen (Kinase-) Aktivität beeinflusst, sondern vielmehr als Rekrutierungsfaktor für andere genregulatorische Faktoren auftritt. Diese Limitierung im Wirkstoffdesign blockiert nicht nur eine therapeutische Umsetzung, sondern limitiert auch unser grundlegendes Verständnis der Rolle von CDK6 in der Genregulation. Die wissenschaftliche Hypothese dieses Projektes ist, dass neue Wirkstoffe, die sämtliche biologische Funktionen von CDK6 blockieren könnten, nicht nur ein eventuell weitreichendes therapeutisches Potential hätten, sondern auch unser Verständnis der genregulatorischen Rolle von CDK6 signifikant verbessern würden. Wir wollen deshalb neue Wirkstoffe entwickeln, die den zellulären Proteinabbau so beeinflussen, dass CDK6 erkannt und komplett abgebaut wird. Basierend auf dem Ansatz der Phthalimid-Konjugation werden wir bifunktionale Moleküle entwickeln, die die E3 Ligase Cereblon modulieren und so den Abbau von CDK6 induzieren können. Wir wollen diese Wirkstoffe einsetzen, um die globalen und Genom-weiten Implikationen von CDK6 auf die Chromatin-Struktur und - Zugänglichkeit, sowie auf die Genregulation in leukämischen Zelllinien und primären Patientenproben zu testen. Schlussendlich wollen wir das therapeutische Potential dieser Wirkstoffe in vivo testen.

In dem Antrag "Charting and Disrupting the Gene-Regulatory Function of CDK6" haben wir einen multidisziplinären Ansatz entwickelt, um die Rolle von CDK6 bei aggressiven Blutkrebsarten zu verstehen. Von CDK6 und dem eng verwandtem CDK4 wusste man hauptsächlich, dass beides Proteinkinasen sind, die an der Kontrolle der Zellteilung beteiligt sind. Die Deregulierung der Zellzykluskontrolle wurde häufig mit Krebs in Verbindung gebracht. Wirkstoffe, die die Aktivität von CDK4 und CDK6 blockieren werden erfolgreich bei der Behandlung bestimmter Krebsarten eingesetzt. Kürzlich wurde gezeigt, dass CDK6 auch die Genaktivität direkt steuert. Interessanterweise ist diese Rolle spezifisch für CDK6 gegenüber CDK4. Leider gibt es jedoch keine selektiven Hemmer der Aktivität von CDK6. Darüber hinaus deuten genetische Experimente auf eine Kinase-unabhängige Funktion von CDK6 in der Genkontrolle hin. Diese Funktion kann man mit momentan verfügbaren pharmakologischen Methoden prinzipiell nicht blockieren. Um diese Probleme zu lösen, bestand das Ziel dieses Antrages darin, Wirkstoffe zu entwickeln, die zum gezielten und selektiven Abbau von CDK6 führen. Dies wurde durch die systematische Entwicklung heterobifunktioneller Wirkstoffe (sogenannter "PROTACs") erreicht, die von bekannten CDK4/6 Inhibitoren abgeleitet wurden. Wir konnten eine Verbindung identifizieren, die eine sehr starke Destabilisierung von CDK6 induziert, indem sie CDK6 zu einer E3-Ubiquitin-Ligase namens CRBN rekrutiert. Interessanterweise induzierte diese Verbindung nicht den Abbau des eng verwandten CDK4, obwohl sie CDK4 und CDK6 mit vergleichbaren Affinitäten bindet. Um diese Selektivität zu verstehen, entwickelten wir ein neuartiges Testverfahren, das uns erlaubt, die Dimerisierung zwischen CDK4/6 und CRBN zu messen. Dieses Verfahren ergab, dass unsere Verbindung eine Dimerisierung zwischen CDK6 und CRBN induzierte, während sie CDK4 und CRBN nicht dimerisierte. Mit diesem neuen Wirkstoff war es uns möglich, verschiedene Blutkrebszellen hoch selektiv eliminieren zu können. Dies ist von besonderer Bedeutung, da selektive Medikamente dazu neigen, einen potenziellen therapeutischen Index zu erhöhen. Um die Selektivität unserer Verbindung über den CDK4 / 6-Vergleich hinaus weiter zu untersuchen, haben wir die zelluläre Behandlung mit der globalen Expressionsproteomik gekoppelt. Dies ist ein Experiment, mit dem wir die Expressionsniveaus von Tausenden von Proteinen als Folge der medikamentösen Behandlung überwachen können. Interessanterweise war CDK6 das einzige destabilisierte Protein, welches ein unübertroffenes Selektivitätsprofil bestätigte. In weiterer Folge verwendeten wir diesen Wirkstoff, um die Rolle von CDK6 in akuten myeloischen Leukämiezellen weiter zu untersuchen. Dazu haben wir Phosphoproteomik und mRNA-Sequenzierung verwendet. Diese Experimente zeigten auf, dass CDK6 auch bisher unbeschriebene zelluläre Mechanismen kontrolliert. Dies wird Gegenstand künftiger Forschung sein. Zukünftige Forschung wird auch erforderlich sein, um das therapeutische Potenzial des pharmakologischen CDK6-Abbaus für die Behandlung von Blutkrebs und darüber hinaus eindeutig zu untersuchen.