Ist Epiplakin ein echtes Keratin-Chaperon?

Das Protein Epiplakin zeichnet sich durch ungewöhnliche Größe und strukturellen Aufbau aus. Es wird ausschließlich in Epithel-Zellen gefunden, in denen es an Keratine bindet, welche Proteine darstellen, die Filamente des Zytoskeletts ausbilden. Mäuse, denen mit Hilfe von gentechnischen Methoden Epiplakin aus dem Körper entfernt wurde, zeigten keine offensichtlichen Unterschiede im Vergleich mit normalen Mäusen. Als jedoch diese Tiere mit normalen Mäusen in Bezug auf ihre Empfindlichkeit für verschiedenen Stress- Bedingungen in der Bauchspeicheldrüse und der Leber verglichen wurden, zeigte sich, dass sie in jenen Erkrankungen, die zu einer markanter Hochregulation von Epiplakin und Keratinen führten, stärker ausgeprägte Gewebeschäden aufwiesen. Epiplakin-freie Bauchspeicheldrüsen und Lebern besaßen außerdem eine größere Zahl von Zellen die Keratin-Aggregate ausbildeten, was auf eine Störung der stressinduzierten Keratin-Reorganisation schließen lässt. In Übereinstimmung mit diesen Daten zeigten aus Epiplakin-freien Lebern entnommene Zellen nach induzierter Überexpression von K8 eine erhöhte Zahl von Keratin- Aggregaten in Kombination mit Zelltod. Dieser Effekt konnte durch die Gabe einer Substanz verhindert werden, die die Bildung von Keratin-Aggregaten unterbindet. Diese Studien zeigen, dass Epiplakin während unterschiedlicher Formen von experimenteller Schädigung der Bauchspeicheldrüse und der Leber eine schützende Rolle spielt, indem es die krankheitsinduzierte Keratin-Reorganisation überwacht. Wir haben deutliche Hinweise darauf, dass die gesteigerte Bildung von Keratin-Aggregaten in der Abwesenheit von Epiplakin für den schwereren Verlauf von stressinduzierter Organschädigung in Epiplakin-losen Mäusen verantwortlich ist. Diese Daten deuten darauf hin, dass Epiplakin ein für Keratine maßgeschneidertes Hilfsprotein während ihrer Reorganisation in einfachen Epithelien ist. In diesem Projekt wollen wir diese möglichen Funktionen von Epiplakin in einfachen Epithelien weiter aufklären indem wir eine Kombination von Ansätzen durchführen, die auf genetisch veränderten Mauslinien, mikroskopischen Analysen und biochemischen Methoden beruhen. Wir planen Mauslinien herzustellen, die kein Epiplakin besitzen aber unterschiedliche Mengen von Keratinen herstellen, um zu überprüfen ob diese Keratin-Mengen auf die Probleme der Epiplakin-freien Mäuse einen Einfluss haben. Für den Mikroskopie-Teil ist das Hauptziel die Sichtbarmachung von Epiplakin und Keratin in lebenden Zellen, um deren Lokalisation und Bewegungen erfassen zu können. Darüber hinaus werden wir Interaktions-Studien mit Epiplakin und Keratinen in Probegefäßen durchführen. Ich erwarte aufklären zu können, wie genau Epiplakin seine vorgeschlagenen Keratin-Überwachungs-Funktionen ausübt. Solche Erkenntnisse würden unser Wissen über jene Mechanismen enorm verbessern, die für die Formierung und den Abbau von Keratin-Filamenten verantwortlich sind und heute bei weitem nicht so gut verstanden sind wie die für andere in Zellen vorhandene Filament-Systeme. Obwohl bisher keine humanen Patienten bekannt sind, die Mutationen in ihren Epiplakin-Genen aufweisen, erwarte ich, dass unsere Erkenntnisse die Suche nach solchen Individuen auslösen werden. Unsere Daten könnten schlussendlich beweisen, dass das Fehlen von Epiplakin verantwortlich für den negativen Verlauf von verschiedenen Erkrankungen des Verdauungstraktes ist.

Keratine bilden Filamente im Inneren der Zellen der meisten Tiere. Sie üben wichtige Funktionen wie die Stärkung von Zellen aus, wenn diese verschiedenen Formen von Stress ausgesetzt sind. Keratine sind nicht einfach nur starre "Kabel", sie müssen auch in der Lage sein, sich zu verändern, wenn sich die Zellen an besondere Bedingungen anpassen müssen. Das Protein Epiplakin zeichnet sich durch seine ungewöhnliche Größe und Struktur aus. Es kommt nur in Epithelzellen vor, wo es mit Keratinfilamenten kolokalisiert. Biochemische Experimente zeigten, dass Epiplakin an Keratine bindet. Gentechnisch veränderte Mäuse, welche kein Epiplakin produzieren, wiesen keine offensichtlichen Unterschiede zu normalen Mäusen auf. Verglich man diese Mäuse jedoch mit normalen Mäusen hinsichtlich ihrer Anfälligkeit für verschiedene Stressbedingungen in Bauchspeicheldrüse und Leber, so zeigten sie bei bestimmten Krankheiten deutlich erhöhte Gewebeschäden. Darüber hinaus wiesen Pankreas und Leber ohne Epiplakin eine erhöhte Anzahl von Zellen mit Keratinaggregaten auf, was auf eine gestörte krankheitsbedingte Reorganisation des Keratinnetzwerks hindeutet. Diese Studien zeigen, dass Epiplakin bei verschiedenen Formen von experimentell induzierten Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse und der Leber eine schützende Rolle spielt, indem es die krankheitsbedingte Reorganisation des Keratinnetzwerks kontrolliert, der Mechanismus dafür ist jedoch noch unklar. In diesem Projekt konnten wir zeigen, dass Epiplakin in allen Tieren mit einer Wirbelsäule wie Fischen, Fröschen, Eidechsen, Vögeln und Säugetieren vorkommt. Dieser Befund stützt unsere Annahme, dass Epiplakin wichtige Funktionen für all diese verschiedenen Arten hat. Darüber hinaus haben wir experimentelle Daten gewonnen, die dazu beitragen werden, die Bedingungen aufzudecken, unter denen Epiplakin Funktionen ausübt, die für den Organismen von Nutzen sind. Durch Mikroskopie von lebenden Zellen, die Epiplakin und Keratin produzieren, die mit fluoreszierenden Proteinen markiert sind, konnten wir eine unerwartete und bisher nicht nachgewiesene diffuse zelluläre Lokalisierung von Epiplakin unter normalen Bedingungen feststellen. Dieser Zustand änderte sich schnell, wenn verschiedene Arten von Stress induziert wurden, wie z. B. Bestrahlung mit ultraviolettem Licht, die eine perfekte Kolokalisierung von Epiplakin mit Keratinfilamenten bewirkten. Die Relokalisierung von Epiplakin war reversibel und abhängig von einer Erhöhung des Ca2+-Spiegels in der Zelle. Diese Eigenschaft von Epiplakin wurde bisher übersehen, da es in mikroskopischen Aufnahmen von Zellen fast immer vollständig mit Keratin assoziiert ist, wenn diese Zellen für die Mikroskopie standardmässig vorbereitet und somit abgetötet worden sind. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass die Assoziation von Epiplakin mit Keratinfilamenten zu einer deutlich reduzierten Dynamik der Keratinfilamente führt. Daher ziehen wir die Schlussfolgerung, dass Epiplakin das Keratinnetzwerk unter solchen Stressbedingungen stabilisiert, die mit erhöhtem zytoplasmatischem Ca2+ Mengen einhergehen.