Struktur, Funktion, und Regulation von Proteinkinase D

Proteinkinase D (PKD) ist eine Kinase, die durch das in der Membran eingebettete Signalmolekül Diacylglycerin (DAG) aktiviert wird und eine Vielzahl zellulärer Signaltransduktionswege reguliert. Durch die Phosphorylierung von Effektormolekülen kontrolliert PKD essentielle Prozesse, wie die Sekretion von Proteinen an die extrazelluläre Umgebung, den intrazellulären Transport von Molekülen und die Änderung der Zellform. Während die spezifischen Bereiche von PKD, die auf DAG ansprechen bereits identifiziert wurden, ist der Mechanismus der zur Aktivierung der Kinase führt noch unbekannt. Dieser Forschungsantrag möchte dieser Frage mit Hilfe komplementärer strukturbiologischer, biophysikalischer, biochemischer und zellbiologischer Methoden nachgehen. Wir stellen die Hypothese auf, dass PKD durch Dimerisierung und Autophosphorylierung aktiviert wird, wobei eine aktivierende Phosphatgruppe von ATP auf ein benachbartes PKD-Molekül übertragen wird. Unsere bisherigen Experimente belegen, dass dieser Vorgang durch eine zuvor unidentifizierte Domäne, die sich im regulatorischen Teil von PKD befindet, vermittelt wird. Interessanterweise besteht die Funktion dieser Domäne scheinbar auch darin den momomeren und inaktiven Zustand von PKD zu stabilisieren. Dieser Antrag möchte auf diesen Beobachtungen aufbauen und zielt darauf ab herauszufinden, wie PKD in Anwesenheit eines Stimulus aktiviert wird, aber in der Abwesenheit eines Stimulus in einem inaktiven Zustand verharrt. Für dieses Projekt nützen wir eine breites Spektrum von hoch- und niedrigauflösenden strukturbiologischen und biophysikalischen Methoden, um Aufschluss über die biochemischen und physikalischen Eigenschaften von PKD zu erhalten. Um die Funktionsweise von PKD in der Zelle zu untersuchen, werden wir hochmoderne Fluoreszenzmikroskopie an lebenden Zellen durchführen, die uns Hinweise zur räumlichen und zeitlichen Aktivität von PKD liefern wird. Gereinigte Komponenten von PKD werden wir biochemisch in vitro charakterisieren. Um unsere Erkentnisse auf den zellulären Kontext übertragen zu können und die Bedeutung von PKD in Insulin- und Zytokinsekretion zu untersuchen, kollaborieren wir mit der Forschungsgruppe von Dr. Romeo Ricci (IGGMC, Straßburg, Frankreich). Obwohl die Dimerisierung von PKD und die Transaktivierung bereits früher vorgeschlagen worden ist, ist bislang kein grundlegender molekularer Mechanismus bekannt. Die Identifizierung einer neuen Dimerisierungsdomäne in PKD unterscheidet PKD von der bisher berühmteren Kinase PKC. Wir erwarten, dass die erfolgreiche Durchführung des hier vorgeschlagenen Forschungsprojekts einen Meilenstein in unserem Verständnis dieses unterschätzten, aber entscheidenden, Signalenzyms darstellt.

Wir bestehen aus Millionen spezialisierter Zellen, die unzählige, notwendige Funktionen ausführen, um uns am Leben zu erhalten und müssen auf Umwelteinflüsse adäquat reagieren. Um zur richtigen Zeit am richtigen Ort ihre Funktion korrekt auszuführen, braucht jede Zelle eine strenge Kontrolle von Wachstum, Vermehrung, Differenzierung, Stoffwechsel, Form und Bewegung. Eine zentrale Rolle in dieser Kontrollfunktion spielen Proteinkinasen. Diese Enzyme können durch das anbringen kleiner chemischer Gruppen, sogenannter Phosphate, die Funktion anderer Proteine beeinflussen und dadurch Signale in einer Zelle verbreiten. Wir haben systematisch analysiert, wie solche Proteinkinasen in Raum und Zeit kontrolliert werden können, indem sie Membranen (in der Zelle wichtig zum Abgrenzen und Definieren von Räumen), als Treffpunkte, Stütze oder zum gezielten Starten von Reaktionen benützen. Der Fokus dieser Arbeit war die Proteinkinase D (PKD), die in der Zelle den Transport von membranverpackten Stoffen kontrolliert. Wir haben eine neue Domäne des Proteins identifiziert, die der Dimerisierung (also dem Zusammenbinden zweier Kopien) von PKD dient und einen einzigartigen Mechanismus entdeckt, der PKD kontrolliert. Die Dimerisierung dient hierbei dazu die aktiven Domänen zweier Kopien des Enzyms in einer Weise aneinanderzubinden, die deren Aktivität hemmt. Dieser Status wird nur aufgehoben, wenn PKD an das Membranlipid Diacylglycerin bindet. Dadurch werden die aktiven Domänen getrennt und deren Hemmung aufgehoben, sodass jede sich selbst (in cis) mit einem Phosphat an einer Serin Aminosäure in seinem Aktivierungssegment modifizieren kann. Dieser regulative Schalter bewirkt zwei Dinge: (1) das inaktive Dimer kann sich nicht mehr bilden und (2) PKD kann schneller und effizienter andere Proteine modifizieren. Da unsere Entdeckung das spiegelgleiche Gegenteil des klassischen Aktivierungsmechanismus von Kinasen ist, ist das Konzept besonders spannend. Viele Kinasen brauchen für ihre Aktivierung ein Signal, zum Beispiel die Bindung an einen Liganden, welche ihre Dimerisierung erlaubt, sodass sich zwei Kopien gegenseitig phosphorylieren können (in trans). Wobei dieser Mechanismus zuerst für Rezeptor-Tyrosinkinasen etabliert wurde, ist er mittlerweile gemeinhin als ein klassischer Weg der Aktivierung von Kinasen akzeptiert. In einer Folgestudie werden wir nun überprüfen, ob PKD in diesem Aspekt einzigartig ist, oder ob die Tragweite unsere Erkenntnis auch andere Kinasen erfasst. Weiters hat diese Projektfinanzierung auch zur Realisation anderer Arbeiten an membranregulierter Signalübertragung beigetragen. In den Kinasen Akt, PDK1 und Sgk3 konnten wir Mechanismen zur Hemmung der eigenen Aktivität und/oder deren Selbstaktivierung in trans identifizieren sowie beschreiben. Ein weiteres Regulationskonzept, das wir in ROCK entdeckt hatten, konnten wir auf die Familie der DMPK-Kinasen ausweiten. Durch diese Studien konnten grundlegende Prinzipien der Regulation von membranabhängigen Kinasen und deren Selbstaktivierung in cis und trans, sowie Funktionen in zellulären Gerüsten offengelegt werden. Zusammengenommen konnten wir wichtige neue Einblick in die Regulation essenzieller zellulärer Schaltvorgänge liefern und ein solides neues Rahmenwerk für die Durchführung weiterführender Arbeiten an solchen molekularen Schaltern schaffen.