Ribosomale Synthese von Peptid Microarrays und modifizierte mRNA Anwendungen

Peptid Microarrays sind eine aktuelle Technologie zur Identifizierung und und effizienten Analyse von Protein-Protein Bindungsinteraktionen in pharmazeutischer und biomedizinischer Proteomik. Die Chrakterisierung dieser Bindungsinteraktionen ist auschlaggebend für das Verständnis von biochemischen Signalwegen innerhalb der Zellen und deren Netzwerke, da Proteine die wesentlichen Mediatoren dieser Prozesse sind. Spezifische Anwendungen von Peptid Microarrays beinhalten Epitopkartierungen, Profilierung von Enzym- und Substrataktivitäten, Überwachung der Reaktionen von Immunseren, sowie Ligand-Bindungsscreenings für die Identifizierung von Biomarkern und für die Drogendiagnostik. Peptid Microarrays stellen eine hohe Herausforderung bei der Peptidsynthese aufgrund der relativen Komplexität dieser Chemie dar. Das Ziel dieses Projektes ist die Entwicklung einer alternativen Methode zu herkömmlichen Methodik von Peptidarrays: statt einer chemischen Peptidsynthese soll die mRNA Technologie eingesetzt werden, bei der Ribosomen zur in situ Umwandlung von hochverdichteten RNA Microarrays in Peptid Microarrays verwendet werden. Dieses Vorgehen bedient sich des Vorteils der Geschwindigkeit und Einfachheit der Nukleinsäuresynthese und der Effizienz der ribosomalen Translation. Die RNA Microarrays werden photolithographisch mit photolabilen 5-NPPOC Schutzgruppen- Phosphoramiditen in einer Baumstruktur synthetisiert. Die RNA wird dabei auf einem Ast der Basensequenz synthetisiert, wobei der andere Ast ein Puromycinmolekül als flexiblen Linker enthält. Nach der automatisierten Synthese wird ein in vitro Translationssystem auf den Microarray angewandt. Aufgrund des Nichtvorhandenseins eines Stopcodons kommt es zu einem Halt des Ribosoms am 3-Ende des RNA Astes, wo esbis zur Inkorporation von Puromycin am C-Terminus haften bleibt. Die geplanten Experimente sollen verschiedene alternative Puromycinbefestigungsmethoden entwickeln, wie z.B. eine direkte Inkorporation auf dem Microarray während der Synthese mit einem neuen Puromycin-Phosphoramidit, sowie die Anheftung des Puromycinastes nach der Synthese mittels Click-Chemie und einer photosensitiven Psoralen-Verbindungschemie. Zusätzlich zur effizienten Herstellung von Peptid-Microarrays ist die on-array-Translation selbst ein nützliches Instrument. Als Teil dieses Projektes planen wir, RNA-Microarray-basierte ribosomale Translationssysteme als Hochdurchsatzmethode zu nutzen. Ziel ist hierbei die Optimierung modifizierter RNA für therapeutische Anwendungen, wie beispielsweise die Protein-Substitution für die Behandlung erblich bedingter oder erworbener Krankheiten, Zell-Reprogrammierungen und die Stimulierung von Immunantworten gegen Krebs oder andere Infektionskrankheiten.

Die Ziele des Projekts waren die Entwicklung der Chemie und der enzymatischen Verarbeitung, die notwendig sind, um die Umwandlung von chemisch synthetisierten RNA-Mikroarrays in Peptid-Mikroarrays durch die Verwendung eines zellfreien Translationssystems zu ermöglichen. Diese zellfreien Translationssysteme werden aus Bakterien oder eukaryotischen Zellen gewonnen und enthalten die gesamte molekulare Maschinerie, insbesondere Ribosomen, die für die Peptidsynthese benötigt wird, sowie Transfer-RNA und andere akzessorische Moleküle. Der von uns verwendete Ansatz zur Synthese von RNA-Mikroarrays wurde über viele Jahre hinweg entwickelt, u.a. im Rahmen eines früheren FWF-Projekts, wurde jedoch an der University of Wisconsin und an der McGill University initiiert. Die RNA-Mikroarrays werden mit Hilfe eines photolithographischen Prozesses synthetisiert, der sich an den ähnlichen Prozessen orientiert, die in der Halbleiter-Mikrochip-Industrie verwendet werden, aber modifiziert wurde, um die effiziente Synthese von sehr großen Bibliotheken von Biomolekülen zu ermöglichen. Ursprünglich wurde diese Form der biologischen Photolithographie für die Synthese von Peptidarrays entwickelt, dann aber aufgrund der anspruchsvolleren Chemie, die mit der Festphasen-Peptidsynthese verbunden ist, auf die DNA-Synthese übertragen. Die Anpassung der DNA-Microarray-Synthese an die Chemie der RNA-Microarray-Synthese war ebenfalls sehr anspruchsvoll, führte aber zur Schaffung von RNA, die in der Natur noch viele weitere Funktionen hat, darunter die Informationsspeicherung, aber auch in den molekularen Maschinen in der Zelle, den Ribosomen, die für die Synthese von Peptiden und Proteinen verantwortlich sind. Mit der Schaffung von RNA-Mikroarrays schließt sich also der Kreis zur photolithographischen Synthese von Peptiden, aber dieses Mal über RNA in Form von synthetischen Arrays von Boten-RNA, die mit Hilfe von Ex-vivo-Translationssystemen auf der Oberfläche in Peptide übersetzt werden. Da wir die Synthese chemisch vollständig kontrollieren können, haben wir auch die Möglichkeit, nicht-kanonische Nukleotide und andere Nukleinsäurebausteine, einschließlich Verzweigungsstrukturen, hinzuzufügen, die bei der Umwandlung in Peptidarrays und beim Testen von Hypothesen über die ribosomale Translationsfähigkeit nicht-kanonischer oder chemisch modifizierter RNA-Analoga sowie über die kodonspezifische Translationseffizienz und die Auswirkungen einer Modifikation der Ribosomenbindungssequenz, die dem Ribosom einen Landeplatz für die Anheftung an die Boten-RNA bietet, potenziell nützlich sind. Die Bedeutung nicht-kanonischer oder chemisch modifizierter RNA-Analoga ist durch die Corona-Pandemie für die Öffentlichkeit sehr viel deutlicher geworden. Alle erfolgreichen RNA-basierten Impfstoffe sowie andere RNA-basierte Therapien, die derzeit entwickelt werden, z.B. gegen Krebs und andere Krankheiten, verwenden RNA-Moleküle, die chemisch modifiziert wurden, um einen sofortigen Abbau bei der Injektion zu vermeiden, aber dennoch von zellulären Ribosomen in Proteine übersetzt werden können. Die weitere Entwicklung der therapeutischen Anwendungen von RNA wird höchstwahrscheinlich weitere Modifikationen beinhalten, sowohl solche, die bereits in der Natur vorkommen, als auch solche, die entwickelt wurden, um die Therapien noch effektiver zu machen.