Analyse der Fgf5 Enhancer Landschaft

Im Laufe der Embryonalentwicklung differenzieren die Zellen des Embryos schrittweise in alle Zelltypen des Organismus. Jeder Schritt in der Differenzierung ist verbunden mit massiven Veränderungen im Genexpressionsmuster. Die Exprimierung der meisten entwicklungsbiologisch kontrollierten Gene wird über Enhancer gesteuert. Enhancer sind kurze DNA Sequenzen die mehrere Bindestellen für Transkriptionsfaktoren besitzen. Diese steuern die Expression eines oder mehrere Gene aus der Distanz in bisher nicht verstandener Weise. Weil sich Enhancer im Prinzip irgendwo in der genomischen DNA befinden können, war es in der Vergangenheit schwer, sowohl die Anzahl als auch die Positionen im Genom zu bestimmen. Erst mit der weiten Verbreitung von neuen Untersuchungsmethoden wie Next Generation Sequencing wurde festgestellt, dass das Chromatin an Enhancern bestimmte Eigenschaften aufweist, die nun das genaue Kartieren von aktiven Enhancer Elementen genomweit erlaubt. Dadurch wurde zum einen gezeigt, dass die Anzahl an Enhancern weit grösser ist als bisher angenommen und die Zahl an Genen weit übertrifft. Zum anderen wurde auch festgestellt, dass gerade Gene für wichtige Regulatoren während der Entwicklung häufig von mehreren Enhancern gleichzeitig kontrolliert werden. Diese sogenannten Superenhancer zeigen ungewöhnlich hohe Sensibilität auf Störungen was darauf hinweist, dass die einzelnen Elemente miteinander möglicherweise kooperieren. Wir haben einen solchen Enhancer Cluster identifiziert, der während der frühen Embryonalentwicklung aktiviert wird. Diese Schritte können in einem in vitro Modell verfolgt werden, so dass wir nun untersuchen können, wie die einzelnen Elemente zur Aktivierung des Ziel Gens, Fgf5, beitragen. Um die Funktionsweise eines Enhancer Clusters im Detail zu analysieren, werden wir einzelne Enhancer Elemente aus dem Genom entfernen und darauf die Aktivierung von Fgf5 Laufe der Differenzierung untersuchen. Dadurch werden wir den Beitrag einzelner Enhancer zur Regulation von Fgf5 bestimmen können. Zusätzlich werden wir die Chromatin Landschaft an den verbliebenen Enhancern genau untersuchen um mögliche Kollaborationen zwischen Enhancern zu identifizieren. In der dreidimensionalen Architektur des Zellkerns können Enhancer und Promoter des Ziel Gens miteinander interagieren was zur Regulation beiträgt. Um zu testen wie der Verlust einzelner Enhancer auf die Architektur um Fgf5 auswirkt, werden wir die Interaktionen im dreidimensionalen Raum während der Differenzierung untersuchen. Zusätzlich werden wir uns die einzelnen Enhancer genauer anschauen, um die treibenden Transkriptionsfaktoren anhand ihrer Bindung an die Enhancer zu identifizieren. Zusammen werden die hier vorgeschlagenen Versuche es uns erlauben das erste umfassende Model für die Wirkung von Enhancer Clustern in Säugetieren zu formulieren und unsere Ergebnisse werden zum fundamentalen Verständnis der Genregulation beitragen.

Enhancer sind genetische Elemente, die die Aktivität eines Gens aus der Distanz kontrollieren. Jeder Enhancer besteht aus mehreren Bindestellen für Transkriptionsfaktoren. Im aktiven Status binden die Transkriptionsfaktoren dort und rekrutieren Co-Aktivatoren, die dann zur Aktivierung des Zielgens führen. The Identifizierung von Enhancern erfolgt häufig über eine kombinatorische epigenomische Signatur: Viele Enhancer zeigen die Bindung von dem Co-Aktivator p300 und spezifischen Modifikationen der umgebenden Histone. Mit Hilfe von genom-weiten Analysen wurde die aktive Enhancerlandschaft in sehr vielen verschiedenen Zelltypen kartiert. Daher wissen wir jetzt, welche Elemente in einem für uns interessanten Zelltyp aktiv sind. Allerdings ist unser Verständnis, wie Enhancer ihr Zielgen aktivieren immer noch rudimentär. In dieser Studie haben wir uns auf die Frage fokussiert, wie mehrere Enhancer miteinander interagieren und wie sie zusammen die Expression des Zielgens steuern. Viele Gene werden nicht nur von einem Enhancer kontrolliert, sondern von mehreren Enhancern zusammen, die einen Cluster bilden. Es ist unklar, wie diese Elemente dann zusammenarbeiten, um kollaborativ das Zielgen zu aktivieren. Wir haben einen Lokus im Detail studiert, um zu verstehen, wie die einzelnen Elemente alleine und in Kombination miteinander das Zielgen Fgf5 steuern. Ein Enhancer Element in der Nähe des Promoters amplifiziert die Expression des Zielgens Fgf5, aber nur, wenn andere Enhancer Elemente auch präsent sind. Alleine und ohne die anderen Elemente hat dieses Element kaum Enhancer Aktivität. Diese Daten deuten darauf hin, dass nicht alle Enhancer, die durch ihre epigenomische Signtaur identifiziert wurden, auch in derselben Art und Weise funktionieren. Im weiteren haben wir gezeigt, dass Polymerase II, eines der Enzyme das DNA in RNA transkribiert, an dem Enhancer selbst akkumuliert. In der Vergangenheit wurde angenommen, dass die Stärke eines Enhancers direkt mit der Menge an Polymerase II am Enhancer korreliert. Das ist an unserem Enhancer hier allerdings nicht der Fall, da dieses Element selber eine sehr geringe intrinsische Enhancer Aktivität besitzt. Zusätzlich haben wir darum die genome-weite Korrelation von intrinsischer Enhancer Stärke und Polymerase II Akkumulation untersucht und auch hier hat sich gezeigt, dass Enhancer Stärke und Polymerase Korrelation nicht miteinander zusammenhängen. Stattdessen scheint der Abstand eines Enhancers zum nächsten aktiven Promoter sehr viel stärker mit der Polymerase II Akkumulation zu korrelieren: Je weiter ein Enhancer von einem aktiven Promoter enfernt ist, desto geringer ist die Menge an Polymerase II an diesem Element. Diese Studie eröffnet nun mehrere neue Forschungsrichtungen: Zum einen konnten wir zeigen, dass Enhancer mit geringer intrinsischer Aktivität trotzdem an der Expression eines Zielgens beteiligt sein können, wenn sie sich im richtigen genomischen Kontext befinden. Diese Erkenntnis wird für die Analyse von Mutationen in potentiellen Enhancern in der Zukunft von Bedeutung sein. Zusätzlich ergibt sich dann die Frage, wie die Akkumulation von Polymerase II zur Funktion des Enhancers beiträgt.