Klonale Hämatopoese als Vaskulärer Risiko-Faktor in der CML

Rezente Studien haben gezeigt, dass die alternde Hämatopoese oft klonal ist und dass die damit assoziierte Anhäufung somatischer Mutationen in myeloischen Stammzellen mit einem erhöhtem Risiko behaftet ist, a) an einer myeloischen Neoplasie zu erkranken und b) eine schwere kardiovaskuläre Erkrankungen zu entwickeln. Entsprechend steigt die Inzidenz der kardiovaskulären Erkrankungen im Alter an und ist auch in bestimmten myeloischen Neoplasien erhöht. Allerdings ist wenig über die entsprechenden zellulären und molekularen Mechanismen bekannt. Eine Hypothese besagt, dass klonale Leukozyten über entzündungsfördernde und gefäßschädigende Wirkungen die Atherosklerose fördern können. Eine andere Hypothese besagt, dass die Gefäßzellen selbst klonal werden können und dass die damit assoziierte Dysfunktion der Endothelzellen die Atherosklerose fördert. Wir und andere Arbeitsgruppen haben vor kurzem gezeigt, dass Patienten mit chronisch myeloischer Leukämie (CML) unter einer Therapie mit Nilotinib oder Ponatinib ein erhöhtes Risiko haben, schwere atherosklerose-assoziierte vaskuläre Ereignisse zu entwickeln. Überdies konnten wir zeigen, dass Nilotinib und Ponatinib direkt pro-atherogen und wachstumshemmend auf Endothelzellen wirken. Außerdem zeigte sich, dass CML Patienten oft eine alters-assoziierte klonale Hämatopoese aufweisen, wobei die entsprechenden Mutationen (TET2, DNMT3A, ASXL1) in der Regel einen Funktionsverlust der betroffenen Antigene (loss of function = LOF) hervorrufen. Diese Mutationen fanden sich vor allem in den CML Patienten welche unter Nilotinib eine schwere kardiovaskuläre Erkrankung entwickelten. Im vorliegenden Projekt soll die Rolle und die zelluläre Verteilung der alters-assoziierten LOF-Mutationen in der CML untersucht werden. In einem ersten Schritt soll die Klonalität der Leukozytenpopulationen und der Endothelzellen bei Diagnose und zum Zeitpunkt des tiefen molekularen Ansprechens getestet werden. In einem weiteren Schritt werden LOF-Effekte auf pro-atherogenen Funktionen und das Wachstum von humanen Makrophagen und Endothelzellen mit Hilfe von CRISPR Cas 9 und shRNA untersucht. Zusätzlich soll der LOF-Effekt in verschiedenen Mausmodellen untersucht werden, inklusive einer Ldlr-/- Maus, welche mit LOF-Gen-defizienten Mäusen gekreuzt werden soll. Um die frühesten pluripotenten Stadien der CML-Differenzierung zu untersuchen soll auch ein iPSC Modell mit primären CML Zellen etabliert werden, in welchem die Effekte bestimmter Medikamente (inklusive Nilotinib und Ponatinib) auf die Differenzierung der CML Stammzellen in Endothelzellen und Makrophagen untersucht werden kann. Die Langzeitziele unserer Studie sind, 1) therapeutisch relevante Signalwege zu identifizieren, welche die Differenzierung der frühen CML Stammzellen in Endothelzellen und/oder Makrophagen steuern, 2) pro-atherogene und wachstumshemmende Effekte der LOF-Mutationen auf Endothelzellen und Makrophagen zu studieren, und 3) Medikamente zu identifizieren, welche die Differenzierung der CML Stammzellen in Endothelzellen und Makrophagen unterdrücken und/oder den pro-atherogenen Effekten der LOF Mutationen entgegenwirken können. Die entsprechenden Resultate sollten zu einem besseren Verständnis der Mechanismen führen, welche der Entstehung von schweren kardiovaskulären Veränderungen unter Nilotinib oder Ponatinib zugrunde liegen. Überdies sollten unsere Resultate zur Entwicklung von neuen therapeutischen Ansätzen führen, über welche die Entstehung schwerer kardiovaskulären Erkrankungen unter Nilotinib oder Ponatinib verhindert werden können.

Die alters-assoziierte klonale Hämatopoese findet sich häufig in myeloischen Leukämien und gilt auch als Risikofaktor für die Entstehung von kardiovaskulären Ereignissen (CVE) oft mit Gefäßverschluss. In der chronisch myeloischen Leukämie (CML) kommt es vor allem unter der Therapie mit bestimmten Medikamenten, wie Nilotinib oder Ponatinib, zur Entwicklung von zum Teil schweren CVE. Im vorliegenden Projekt wurde der zugrunde liegenden Mechanismus untersucht und nach alternativen Therapieoptionen geforscht. Zunächst konnte gezeigt werden, dass alters-assoziierte Mutationen nicht nur in CML Stammzellen exprimiert werden sondern ebenso in Monozyten und fallweise auch in Endothelzellen. Die am häufigsten mutierten Gene waren DNMT3A, TET2 und ASXL1. Nilotinib und Ponatinib blockierten das Wachstum der Endothelzellen und Nilotinib induzierte auch die Expression von pro-atherogenen Molekülen, während Asciminib, ein neues anti-CML Medikament, keine Endothelzell-aktiven Wirkungen entfaltet, was für eine bessere Verträglichkeit dieses Medikamentes spricht. In einem weiteren Schritt wurde untersucht, ob eine Blockade der Nischenzellen (Endothelzellen, Osteoblasten) die Nischen-induzierte Resistenz der CML Zellen durchbrechen kann. Zunächst zeigte sich, dass Osteoblasten eine beinahe komplette Resistenz der CML Zellen gegenüber Nilotinib und Ponatinib vermitteln. Ferner konnte gezeigt werden, dass Medikamente, welche die PI3 Kinase (PI3K) blockieren, sowohl das Wachstum der Osteoblasten hemmen als auch die Nischen-induzierte Resistenz der CML Zellen durchbrechen können. Da die PD-1/PD-L1 Achse eine Rolle in der Resistenz der CML Zellen als auch in der Genese von CVE spielt, wurde auch die Expression dieser Moleküle untersucht. Dabei zeigte sich, dass sowohl Endothelzellen und Osteoblasten PD-L1 exprimieren und dass Interferon-gamma (IFN-G) und Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-A) die Expression von PD-L1 in diesen Zellen verstärken. Der BRD4/MYC Inhibitor JQ1 und die BRD4 Degrader dBET1 und dBET6 blockierten die Zytokin-induzierte Expression von PD-L1 in diesen Zellen. Ähnliche Daten konnten mit CML Zellen erhoben werden. Wiederum konnte die Expression von PD-L1 durch IFN-G und TNF-A verstärkt werden, und wiederum blockierten die gegen BRD4/MYC gerichteten Medikamente die Zytokin-induzierte Expression von PD-L1. Zusammenfassend zeigen die erhobenen Daten, dass alters-assoziierte Mutationen mit einem erhöhten CVE Risiko in der Nilotinib-therapierten CML einhergehen und dass sowohl Nilotinib als auch Ponatinib die Endothelzell-Funktionen im Sinne eines CVE Risikos beeinflussen können, während Asciminib keine Endothelzell-Aktivität aufweist. Überdies zeigte sich, dass Osteoblasten eine Resistenz gegenüber Nilotinib und Ponatinib vermitteln und dass PI3K Inhibitoren diese Resistenz durchbrechen können. Letztlich zeigte sich, dass Endothelzellen, Osteoblasten und CML Zellen das Checkpoint-Molekül PD-L1 exprimieren.