Funktionsanalyse von pflanzlichen TOL Proteinen

Pflanzen als festsitzende Organismen müssen schnell und präzise auf eine sich ständig verändernde Umwelt reagieren. Die Plasmamembran ist die Schnittstelle zwischen Innen und Außen in einer Zelle und ist bespickt mit Proteinen, die wesentlich für die Erfassung und Übertragung von internen und externen Reizen sind. Eine strenge Kontrolle der Anzahl aber auch der Lokalisierung dieser Proteine ist von entscheidender Bedeutung für adaptive Prozesse. In Eukaryonten wird dies durch ein komplexes System von Membranvesikeln ermöglicht, die dazu dienen Proteine an ihren Wirkungsort zu transportieren oder wieder abzutransportieren. Proteine, die für den Abbau bestimmt sind werden ubiquitiniert, endozytiert und zur Zerstörung zu der Vakuole gebracht. Dies passiert durch eine komplexe Maschinerie, die ESCRT-Maschinerie. Wir konnten vor kurzem zeigen, dass zur anfängliche Erkennung der Proteine welche abgebaut werden sollen die evolutionär konservierte Proteinfamilie der TOLs gebraucht wird. Das Hauptziel dieses Projektes ist es herauszufinden nicht nur wo, sondern auch wie, die TOL Proteine im Endomembran-system lokalisieren und somit Determinanten zu finden, welche die TOL-Protein Verteilung und Menge kontrollieren. Dies ermöglicht uns die Funktion dieser Proteinfamilie in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana genauer zu analysieren und trägt zusätzlich dazu bei spezifische Funktionen einzelner TOLs herauszufinden. Damit wird dieses Projekt nicht nur eine Lücke im Wissen über das endosomale System der Pflanzen schließen, sondern auch als Grundpfeiler für zukünftige Studien dienen. Die hier vorgeschlagene Arbeit wird unser Verständnis zur Rolle der TOL- Proteinen in Pflanzen erheblich verbessern, indem sie neue Einblicke in die Regulation von ubiquitinierten Membranproteinen in Pflanzen ermöglicht und somit Mechanismen aufklärt, die ermöglichen Pflanzenwachstums und Entwicklung auf die Umwelt feinabzustimmen.

Durch den sich beschleunigenden Klimawandel und die dadurch rasant ansteigenden extremen Umweltbedingungen, ist die Frage wie Pflanzen sich flexibel an ihre sich ständig verändernde Umgebung anpassen können, ein hochaktuelles Forschungsgebiet. Die Plasmamembran dient als Grenze zwischen dem Inneren und dem Äußeren der Zelle und ist dicht gepackt mit Proteinen, die für die Wahrnehmung und Weiterleitung von Reizen verantwortlich sind. Reaktionen auf Stress werden zum Beispiel durch Phytohormone reguliert und koordiniert, deren Transport und Wahrnehmung im Allgemeinen von diesen Plasmamembran-lokalisierte Proteine durchgeführt werden. Pflanzen müssen also in der Lage sein nicht nur die Lokalisation, sondern auch die Menge ihrer Plasmamembranproteine schnell und genau zu kontrollieren und zu regulieren. Dies wird durch endosomalen Transport organisiert, der Membranproteine zu und von ihrem Wirkungsort transportiert. Eine Schlüsselfunktion hat hier die post-translationale Modifikation von Plasmamembranproteinen mit dem kleinen Protein Ubiquitin. Ubiquitinierung signalisiert, dass das Protein durch Endozytose von der Plasmamembran entfernt wird und im Weiteren zum Abbau zur Vakuole transportiert wird. Dieses Projekt hat die TOM1-ähnlichen (TOL) Proteinfamilie untersucht, die bei der Erkennung von ubiquitinierten Plasmamembranproteinen funktionieren. Zu diesem Zweck wurde eine eingehende funktionelle Charakterisierung der TOL-Proteinfamilie im endosomalen System der Modellpflanze Arabidopsis thaliana durchgeführt. Einige der TOL-Proteine lokalisiert an der Plasmamembran, andere jedoch sind im Zytoplasma und in endosomalen Strukturen vorhanden. Konservierte Elemente der endosomalen Signalwege in Pflanzen wurden durch In-vitro- und In-vivo-Bindungsstudien auf ihre Bindung an die TOLs untersucht. Dies trug dazu bei, funktionellen Verbindungen zwischen TOL-Proteinen und der pflanzlichen Sortiermaschinerie zu festigen und positionierte somit die TOLs in den frühen Schritten der Abbauwege von der Plasmamembran bis zur Vakuole. Schließlich untersuchten wir einen möglichen Regulationsweg, der die Ubiquitin-bindenden Domänen einbezieht, die sogenannte gekoppelte Ubiquitinierung. Durch verschiedene Ansätze wie zum Beispiel konstitutive Ubiquitinierung und ziel-gerichtete Mutagenese von Ubiquitin-Bindungsdomänen, untersuchten wir den Einfluss der Ubiquitinierung auf die Lokalisierung und Funktion der TOLs, insbesondere von TOL6. Somit schloss dieses Projekt eine Wissenslücke über das endosomale System der Pflanzen und diente darüber hinaus als wichtiger Grundstein für zukünftige Studien.