NMR Spektroskopie der Methylierung ribosomaler RNA

Enzyme ermöglichen und beschleunigen essentielle chemische Reaktionen in biologischen Zellen und stellen somit die biochemischen Arbeitspferde aller Organismen dar. Um diese Aufgaben zu erfüllen,nehmen Enzyme eine bestimmte dreidimensionale Struktur ein. Gleichzeitig stellt jedoch ein gewisses Maß an struktureller Flexibilität eine notwendige Voraussetzung für die Katalyse von chemischen Reaktion dar. So können beispielsweise sowohl das Erkennen als auch Binden eines Substrats strukturelle Flexibilität erfordern, und strukturelle Umwandlungen am katalytischen Zentrum eines Enzyms können für seine optimale Funktion notwendig sein. Zudem setzt sich mehr und mehr die Erkenntnis durch, daß auch kurzlebige und nur transient vorhandene Strukturen die enzymatische Katalyse entscheidend beeinflussenkönnenund berücksichtigt werden müssen. Mitwenigen Ausnahmen beschäftigen sichroutinemäßige Strukturuntersuchungenvon Enzymen mittels Röntgenkristallographie oder kernmagnetischer Resonanzspektroskopie (NMR) jedoch lediglich mit dem stabilsten vorhandenen Konformer, wodurch eine strukturbasierte Erklärung der experimentellen Beobachtungen vielfach nicht möglich ist. Im Rahmen dieses FWF-Einzelprojekts streben wir eine umfassende Beschreibung der strukturellen Flexibilität des Enzyms RlmJ an. Dieses Protein katalysiert die Methylierung von ribosomaler Ribonukleinsäure (RNA) an einer bestimmten Position und mit hoher Spezifizität. Ribosomlae RNA ist Teil des Ribosoms, einer in allen biologischen Zellen vorhandenen, komplexen molekularen Maschine zur Übersetzung genetischer Information in Proteine. Während die dreidimensionale Struktur von RlmJ bekannt ist, sind die bestimmenden Faktoren der enzymatischen Katalyse auf struktureller Ebene nicht vollständig geklärt. So ist beispielsweise nicht bekannt, wie das Binden von Substrat und die Freisetzung von Produkt reguliert werden, wie genau das katalytische Zentrum dieses Enzyms aufgebaut ist, und welche Rolle strukturelle Flexibilität einnimmt. Im vorliegenden Projekt werden wir mit Hilfe von dynamisch NMR-Spektroskopischen Methoden die strukturelle Flexibilität von RlmJ charakterisieren. Diese Technik ermöglicht die direkte Beobachtung von strukturellen Umwandlungsprozessen mit atomarer Auflösung, auch im Falle von kurzlebigen und nur transient vorhandenen Strukturen. Ergänzt wird dieser Ansatz durch chemisch synthetisierte, isotopenmarkierte und/oder chemisch modifizierte Substrat-RNA zur Strukturbestimmung, der direkten NMR-spektroskopischen Beobachtungder enzymatischen Katalyse, und weiteren biophysikalischen Methoden. Die Verknüpfung unterschiedlicher Techniken ermöglicht es uns, sowohl die Protein- als auch die RNA- Komponente des Systems zu beobachten. Hierdurch erhoffen wir uns umfassende Einsicht in das Zusammenspiel zwischen Struktur, Flexibilität und enzymatischer Katalyse und somit einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis der Funktionsweise von Methyltransferasen.

Im vorliegenden Projekt des Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung FWF wurde die molekulare Wirkungsweise eines Enzyms in atomarer Auflösung charakterisiert. Enzyme ermöglichen und beschleunigen essentielle chemische Reaktionen in biologischen Zellen und stellen somit die biochemischen Arbeitspferde aller Organismen dar. Um diese Aufgaben zu erfüllen, nehmen Enzyme eine bestimmte dreidimensionale Struktur ein. Gleichzeitig stellt jedoch ein gewisses Maß an struktureller Flexibilität eine notwendige Voraussetzung für die Katalyse von chemischen Reaktionen dar. So können beispielsweise sowohl das Erkennen als auch Binden eines Substrats strukturelle Flexibilität erfordern, und strukturelle Umwandlungen am katalytischen Zentrum eines Enzyms können für seine optimale Funktion notwendig sein. Zudem setzt sich mehr und mehr die Erkenntnis durch, daß auch kurzlebige und nur transient vorhandene Strukturen die enzymatische Katalyse entscheidend beeinflussen können und berücksichtigt werden müssen. In unserem Projekt erarbeiteten wir eine umfassende Beschreibung der strukturellen Flexibilität des Enzyms RlmJ. Dieses Protein katalysiert die Methylierung von ribosomaler Ribonukleinsäure (RNA) an einer bestimmten Position und mit hoher Spezifizität. Ribosomale RNA ist Teil des Ribosoms, einer in allen biologischen Zellen vorhandenen, komplexen molekularen Maschine zur Übersetzung genetischer Information in Proteine. Die bestimmenden Faktoren der enzymatischen Katalyse auf struktureller Ebene sind für RlmJ nicht unbekannt. In unserer Arbeit wurde die strukturelle Flexibilität von RlmJ mittels dynamischer Methoden der kernmagnetischen Resonanzspektroskopie (NMR) im Detail charakterisiert. Diese Technik ermöglicht die direkte Beobachtung von strukturellen Umwandlungsprozessen mit atomarer Auflösung, auch im Falle von kurzlebigen und nur transient vorhandenen Strukturen. Ergänzt wurde diese Information durch die chemische Synthese isotopenmarkierter und/oder chemisch modifizierter Substrat-RNA, sowie auch durch direkte NMR-spektroskopische Beobachtung der enzymatischen Katalyse in Kombination mit ergänzenden biophysikalischen Methoden. Die Verknüpfung unter-schiedlicher Techniken ermöglichte es uns, sowohl die Protein- als auch die RNA-Komponente des Systems experimentell zu beobachten. Hierdurch erreichten wir umfassende Einsicht in das Zusammenspiel zwischen Struktur, Flexibilität und enzymatischer Katalyse und somit einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis der Funktionsweise von Methyltransferasen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass strukturelle Flexibilität tatsächlich eine zentrale Rolle für die RNA-Methylierung spielt.