Die Regulation dynamischer Interaktionen zwischen PARG und PCNA

DNA-Replikation und Reparatur sind essentielle zelluläre Prozesse, die die Genomduplikation sicherstellen und das Genom vor schädlichen Mutationen schützen. Beide Prozesse nutzen eine Vielzahl enzymatischer Funktionen, die streng reguliert werden müssen, um den dynamischen Austausch von DNA-Replikations- und Reparaturfaktoren sicherzustellen. Proliferating-Cell-Nuclear-Antigen (PCNA) ist der Hauptkoordinator der genauen und prozessiven Replikation sowie der DNA-Reparatur an Replikationsgabeln. Angesichts der großen Anzahl PCNA-bindender Proteine mit oftmals ähnlichen Bindungsaffinitäten für PCNA ist bisher unklar geblieben, wie die Stärke und Abfolge ihrer Bindung reguliert wird. Posttranslationale Proteinmodifikationen regulieren die Dynamik von Protein-Protein-Interaktionen. Ubiquitinierung und Acetylierung von PCNA bieten ein gutes Beispiel für dieses Paradigma: Während PCNA- Monoubiquitinierung Polymerase Switching auslöst, wobei festgefahrene replizierende Polymerase durch eine spezialisierte Polymerase ersetzt wird, kann PCNA-Acetylierung die Prozessivität replizierender Polymerasen reduzieren, um DNA-Reparatur durch homologe Rekombination zu begünstigen. Regulatorische Funktionen von PCNA-Ubiquitinierung und Acetylierung sind intensiv untersucht worden, wohingegen die Regulation PCNA-bindender Proteine durch posttranslationale Modifikationen weitgehend unerforscht bleibt. Kürzlich haben wir ein neues PCNA-Interaction Protein Motif (PIP-Box) innerhalb der Poly(ADP- Ribose)-Glycohydrolase (PARG) identifiziert. PARG ist ein essentielles Enzym in Eukaryoten, das Poly(ADP-Ribose) spaltet und für Replikation und Erholung nach Replikationsstress notwendig ist. Wir haben gezeigt, dass die Bindung der PARG PIP-Box an PCNA über stabilisierende hydrophobe Wechselwirkungen sowie elektrostatische Wechselwirkungen, die für die Feinabstimmung verantwortlich sind, erfolgt. Zudem scheint PARG durch dieselben Modifikationen, die PCNA kontrollieren, reguliert zu sein. Beispielsweise schwächt Acetylierung von Lysinresten innerhalb der PIP-Box die Interaktion von PARG mit PCNA in vitro. Wir beabsichtigen, Änderungen der Acetylierung und Ubiquitinierung von PARG nach Schädigung der DNA anhand eines Targeted Proteomics-Ansatzes quantitativ zu analysieren. Mithilfe biochemischer und biophysikalischer Assays werden wir die Bedeutung acetylierter und ubiquitinierter Aminosäurereste für die PARG-PCNA-Interaktion und die Modulierung der Bindung nach DNA-Schädigung erforschen. Vornehmlich werden wir den Einfluss acetylierter und ubiquitinierter Reste auf die Funktion von PARG in der DNA- Replikation und DNA-Schadensantwort untersuchen. Dazu werden wir ermitteln, wie Mutationen der entsprechenden Aminosäuren die Lokalisierung, Mobilität und Rekrutierung von PARG zu Replikationsfoci und beschädigten DNA-Stellen beeinflussen, und ob die Mutationen den Verlust von PARG, der in Zellen zu Replikationsstörungen und Anfälligkeit für DNA-Schäden führt, kompensieren können. Alles in allem werden unsere Ergebnisse das Verständnis darüber vertiefen, wie die Interaktion von PARG mit PCNA zur Regulierung der dynamischen Prozesse DNA-Replikation und Reparatur beiträgt. PCNA und PARG sind als klinische Targets in der Krebsforschung von zentraler Bedeutung. Während das Abzielen auf eine häufige Interaktionsstelle von PCNA zu genereller Cytotoxizität führen könnte, sollte die Identifizierung spezifischer, durch Acetylierung und Ubiquitinierung regulierter Reste innerhalb PARGs, die kritisch für die Interaktion mit PCNA sind, das Design zielgerichteter Inhibitoren deutlich vereinfachen.

DNA-Replikation und -Reparatur sind essentielle zelluläre Prozesse, die die Duplikation des Erbmaterials sicherstellen und das Genom vor schädlichen Mutationen bewahren. Beide Prozesse müssen genau reguliert werden, um den dynamischen Austausch von DNA Replikations- und Reparaturfaktoren sicherzustellen. Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) ist der wichtigste Koordinator von genauer und prozessiver Replikation und DNA-Reparatur in Replikationsfabriken. Poly(ADP-Ribose) Glycohydrolase (PARG) ist ein essentielles eukaryotisches Enzym, das Poly(ADP-Ribose) entfernt, mit PCNA interagiert und für Replikation und die Erholung von Replikationsstress notwendig ist. In diesem Projekt haben wir analysiert, wie die PARG-PCNA Interaktion im Kontext von Replikationsgabeldynamik und DNA-Reparatur reguliert ist. Wir haben gezielte massenspektrometrische Analysen von PARG Acetylierung in Reaktion zu verschiedenen Arten von DNA-Schäden und Replikationsstress durchgeführt, gefolgt von funktioneller Charakterisierung ihrer Bedeutung für PARG-PCNA Interaktion, PARG Lokalisierung, Mobilität, Rekrutierung zu Replikationsfoci und geschädigten DNA-Stellen und die zelluläre Antwort auf Replikationsstress und DNA-Schäden. Wir haben herausgefunden, dass stressinduzierte Veränderungen in PARG Acetylierungsstellen nicht für die Regulierung der dynamischen Interkationen zwischen PARG und PCNA notwendig ist. Stattdessen führt die PARG-PCNA Interaktion über die PIP-Box zur Formierung von PARG-PCNA Kondensaten in vitro und in Replikationsfabriken in Zellen. Wir haben PARG HEK293 Zellen, in denen die größte nukleare Isoform fehlt, generiert, die reduzierte Proliferation, eine reduzierte Rate von Replikationsgabeln, Arretierung in der frühen S-Phase und beeinträchtigte Wiederaufnahme von Replikationsgabeln nach Replikationsstress zeigen, sowie sensitiv auf HU und DNA-schädigende Substanzen reagieren, und damit Phänotype rekapitulieren, die zuvor in shPARG Zellen beobachtet wurden. Diese Phänotype können mit PARG PIP-Box Mutanten nicht gerettet werden, was darauf hindeutet, dass die PARG-PCNA Interaktion für die Regulierung von Replikationsfabriken notwendig ist, um ungestörte Replikation und eine effiziente Antwort auf Replikationsstress zu gewährleisten. Als Teil dieses Projektes haben wir auch ein neu etabliertes System, UV-FLIM-FRET, validiert, um Protein-Protein-Interkationen an geschädigten DNA-Stellen auf Einzelzelllevel und mit hoher zeitlicher Auflösung zu beobachten und zu quantifizieren. Unsere Studie stellt die erste Charakterisierung der Effekte von PCNA-interagierenden Proteinen auf PCNA-Clustering durch Kondensatformierung dar, und könnte ein neues Paradigma darüber aufstellen, wie multivalente Interaktionen Proteinlokalisierung und -häufigkeit in Replikationsfabriken dynamisch modulieren.