Neue Aufgaben des pflanzlichen N-end rule Proteinabbauweges

Die Entfernung unerwünschter Proteine aus der Zelle ist essentiell für alle Lebewesen. Bei Pflanzen trägt dieser Prozess zur Regulation der Genexpression bei, sowie zur Stressantwort und zu vielen anderen Vorgängen. Proteine können abgebaut werden, indem sie zur Markierung mit dem kleinen Modifikator-Protein Ubiquitin verknüpft werden, was zum Abbau durch die Protease Proteasom führt. Alternativ dazu können Proteine durch den Prozess der Autophagie in das lytische Kompartiment der Zelle, Lysosom, transportiert werden. Der N-end rule Proteinabbauweg war der erste Proteinabbauweg, welcher im Detail entschlüsselt wurde. In Tieren und Pilzen wird Ubiquitin an Proteine angeheftet, welche ein freies amino-terminales Ende mit basischer oder hydrophober Aminosäure aufweisen, was zum Abbau dieser Proteine führt. Die ausführende Ubiquitin Ligase hat eine Bindungsstelle für basische amino-terminale Enden von Substratproteinen, und eine für hydrophobe. Wir untersuchen den N-end rule Abbauweg bei Pflanzen. Während der Abbau von Proteinen mit basischem Amino-Terminus wie in Tieren abläuft, ist der Abbau von Proteinen mit dem hydrophoben amino-terminalen Rest Leu noch nicht entschlüsselt. In unveröffentlichten Arbeiten konnten wir Komponenten dieses neuen Abbauweges, Leu N-end rule, identifizieren. Wir wollen nun herausfinden, wie dieser Abbauweg in die zellulären Aktivitäten eingebunden ist. Mutanten im Leu N-end rule Weg sollen für eine detaillierte Charakterisierung herangezogen werden. Es soll auch bestimmt werden, welche Amino-Termini ein Protein in ein Substrat des Leu N- end rule Weges verwandeln. Für diese Studien wurden besondere Protein-Interaktionstests entwickelt. Diese sollen auch dazu dienen, Proteine zu identifizieren, die an andere Amino- Termini des N-end rule Abbauweges binden. Wir vermuten, dass nicht alle bindenden Proteine am Proteinabbau beteiligt sind. Einige modifizieren möglicherweise ihre Aktivität in Abhängigkeit von der Verfügbarkeit von N-end rule Substraten und tragen so dazu bei, den Abbau von Proteinen in biologische Antworten umzusetzen.

Zusammenfassung der Ergebnisse des Forschungsprojekts "Novel tasks of the plant N-end rule degradation pathway" Der gezielte Abbau von Proteinen ist essentieller Bestandteil vieler Signaltransduktionswege, und generell unerlässlich für die Aufrechterhaltung zellulärer Prozesse. Er wird durch Erkennung einer definierten Struktur, eines sogenannten Abbausignals, eingeleitet. Ziel des Projekts war es, herauszufinden, wie Proteine in Pflanzen abgebaut werden, die am Amino-Terminus als Abbausignal (N-degron) die Aminosäure Leucin tragen, sowie generell neue Erkenntnisse über amino-terminale Abbausignale zu gewinnen. Wir fanden mittels pharmakologischer, genetischer und biochemischer Daten, dass für den Abbau von Proteinen mit Leucin N-degron mehrere Abbauwege existieren. Sowohl das Proteasom, als auch die Vakuole nimmt am Abbau teil. Das war überraschend, denn vorhergehende Studien zu den N-degrons Phenylalanin und Arginin hatten jeweils nur einen Haupt-Abbau-Weg identifiziert. Wir konnten verbesserte Analyse-Methoden erarbeiten, ein neues Modellsubstrat herstellen und einen funktionellen Test etablieren, in dem Komponenten des Proteinabbaus aus der Modellpflanze Arabidopsis in der Bäckerhefe exprimiert werden. Dieser Test war besonders hilfreich zur Untersuchung von Komponenten, die in Pflanzen wegen redundanter Abbauwege nicht einfach getestet werden können. In der Hefe sind diese Komponenten dann die einzigen, welche zum Abbau beitragen. Wir konnten mit diesem Test auch neue Beiträge zum Abbau von Proteinen mit anderen N-degrons (wie z. B. Phenylalanin) finden. Wir haben zwei Gene charakterisiert, die am Abbau von Leu N-degron Substraten teilnehmen. Die eingesetzten Methoden waren Kreuzungen und Genom-Sequenzierung von zuvor erhaltenen Mutanten im Abbau, sowie Komplementation der Mutationen durch Einbringen des Wildtyp-Gens in die Mutante. Wir konnten eine erste Antwort auf die Frage erarbeiten, warum Pflanzen sterben, deren Ubiquitin-abhängiger Proteinabbau nicht voll funktionsfähig ist. Eine Analyse der Transkripte und des Proteoms von Pflanzen mit verminderter Fähigkeit zur zellulären Proteolyse wurde durchgeführt. Wir stellten Probleme bei der Biogenese und Regulation der Chloroplasten fest. Insbesondere der Abbau von Proteinkomplexen des Photorezeptors Phototropin 2 scheint von Bedeutung zu sein. Mit Hilfe der FWF-Unterstützung konnten fünf Artikel publiziert werden. Ein beträchtlicher Teil der Ergebnisse wird zu zukünftigen Veröffentlichungen beitragen. Insgesamt konnten viele neue Erkenntnisse gewonnen werden, wenn der Fortschritt auch langsamer war als vor Projektbeginn erwartet, was mit der unerwarteten Komplexität der untersuchten Abbauwege zu erklären ist.