Die proteinmodifizierende beta-Galaktosidase von Tabak

Die Tabak-verwandte Pflanzenart Nicotiana benthamiana wird zunehmend als Alternative zu tierischen Zellen für die Herstellung von rekombinanten pharmazeutischen Proteinen verwendet. Glykosylierung zählt zu den häufigsten Formen der Proteinmodifizierung in allen Eukaryonten. Die proteingebundenen Zuckerketten beeinflussen zahlreiche biologische Prozesse und sind essenziell für die Entwicklung von Organismen und es gibt zunehmend Hinweise auf eine wichtige Rolle der Zuckerketten für die Wirksamkeit von pharmazeutischen Proteinen. Die Zuckerketten der in Pflanzen hergestellten pharmazeutischen Proteine sind jedoch nicht ident mit denen des Menschen. In den letzten Jahren hat das Team der Antragstellerin eine Methode zur kontrollierten Herstellung von genau definiert proteingebundene Zuckerketten in Pflanzen etabliert. Mit der Methode konnten sehr erfolgreich Antikörpervarianten mit human-spezifischem Glykosylierungsmuster erzeugt und funktionell getestet werden. Bei anderen pharmazeutischen Proteinen wurden jedoch verkürzte Zuckerketten gefunden, bei denen ein wichtiger Zucker, eine Galaktose, abgespalten wurde. Die dafür verantwortlichen Enzyme, beta-Galaktosidasen, sollen in diesem Projekt in N. benthamiana identifiziert und charakterisiert werden. In weiterer Folge, werden Pflanzenlinien generiert, in denen die Expression der identifizierten beta-Galaktosidase blockiert ist. Neben dem biotechnologischen Aspekt, ermöglicht das Projekt die Untersuchung einer bisher weitgehend unbekannten Enzym-Familie in Pflanzen, die eine Rolle bei der pflanzlichen Zellwand-Biosynthese spielt.

Die Verwendung von Pflanzen zur Herstellung menschlicher therapeutischer Proteine, bekannt als Plant Molecular Farming (PMF), stößt weltweit auf Interesse. Neben einem geringen Risiko einer Kontamination mit menschlichen Krankheitserregern bieten Pflanzen das Potenzial, sowohl Kosteneffizienz als auch Skalierbarkeit zu bieten. Die meisten therapeutischen Proteine unterliegen einer Glykosylierung, einer strukturellen Veränderung, die die Anlagerung von Zuckerketten (Glykanen) an bestimmte Aminosäuren mit sich bringt. Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass Proteinpharmazeutika ordnungsgemäß glykosyliert werden müssen, um eine optimale therapeutische Wirksamkeit zu erzielen. Wenn diese Proteine in Pflanzen hergestellt werden, weisen sie eine Glykosylierung auf, die nicht der von Säugetieren ähnelt. Dies kann jedoch durch Glyco-Engineering umgangen werden, was zu einer maßgeschneiderten Glykosylierung führt. Ein wichtiger Zucker auf Proteinglykanen ist Galaktose. Die Tatsache, dass Pflanzenzellen über Enzyme (Galaktosidasen, BGAL) verfügen, die Galaktose aus Glykanen entfernen, schränkt jedoch die Verwendung von Pflanzen als Produktionssystem für rekombinante Glykoproteine ein. Wir haben eine BGAL identifiziert und gezeigt, dass dieses Enzym für die Entfernung terminaler Galaktosezucker aus Proteinen verantwortlich ist, die in Nicotiana-benthamiana-Pflanzen exprimiert werden. Wir haben dann (i) RNA-Interferenz und (ii) Genom-Editierung verwendet, um die BGAL-Aktivität zu beseitigen, und gezeigt, dass diese beiden Strategien effizient sind, um die Mengen an vollständig galactosylierten Glykanen auf pflanzlichen Glykoproteinen zu erhöhen. Die Ergebnisse sind sehr ermutigend für die zukünftige Etablierung einer weiteren pflanzenbasierten Expressionsplattform, die keine -Galactosidase-Aktivität aufweist und somit die menschliche Galactosylierung an einer vielfältigen Gruppe von Glykoproteinen ermöglicht. Anfang 2020 haben wir eine zweite Untersuchungslinie zu eingesetzten Pflanzen zur Bekämpfung der COVID-19-Pandemie gestartet. In Zusammenarbeit mit Wissenschaftlern der Initiative "Medicines for Future (M4F)" bestand unser Ziel darin, "effiziente und erschwingliche Arzneimittel für Menschen auf der ganzen Welt herzustellen, indem wir die Arzneimittelforschung und die skalierbare Herstellung von Arzneimitteln in Pflanzen vorantreiben". Unter den verschiedenen Möglichkeiten, SARS-CoV-2-Infektionen durch Medikamente zu blockieren, ist die Hemmung der Bindung des Virus an seinen Rezeptor (ACE2) auf menschlichen Zellen einer der vielversprechendsten Ansätze für die COVID-19-Therapie. Dies liegt vor allem daran, dass neu auftretende Virusvarianten durch eine verstärkte Bindung ihres Spike-Proteins an den ACE2-Rezeptor gekennzeichnet sind. Im Gegensatz zu anderen antiviralen Mitteln wie Antikörpern zeigen ACE2-Köder eine erhöhte Bindung an Virusvarianten, wodurch der Köder das Virus aktiver neutralisiert. Wir haben ein Täuschmolekül entwickelt, das aus einem ACE2 besteht, das an die Fc-Domäne eines Antikörpers (ACE2-Fc) fusioniert ist. Bei der Herstellung in Pflanzen ist ACE2-Fc mit vereinfachten Glykanen versehen, die im Vergleich zu herkömmlichen biotechnologischen Produktionssystemen offenbar die Bindung an SARS-CoV-2 und die virusneutralisierende Aktivität verbessern. Die neue Methode ist ressourcenschonend, kostengünstig und erzielt eine deutlich höhere Wirkung als herkömmliche Präparate. Die pflanzliche Arzneimittelformulierung wurde in präklinischen Studien getestet und wird voraussichtlich Anfang nächsten Jahres Tierversuchen unterzogen.