PHARMAKOLOGISCHE RETTUNG VON KREATINTRANSPORTER-1 MUTANTEN

Der humane Kreatin-Transporter-1 (hCRT-1) gehört zur solute carrier 6 (SLC6)- Proteinfamilie. Mutationen in der kodierenden Sequenz des hCRT-1-Gens werden mit dem Kreatin-Transporter- Mangel-Syndrom (CTD) assoziiert. Dieses Syndrom umfasst eine Reihe von mäßigen bis schweren Störungen, darunter Epilepsie, geistigeRetardierung,Autismus, psychomotorische Entwicklungsretardierung, Verhaltensauffälligkeiten (Hyperaktivität, Schüchternheit, stereotypisches aggressives und selbstverletzendes Verhalten), Motorische Dysfunktion (steifer Gang, leicht erhöhte Reflexe, Koordinationsschwierigkeiten und Dystonie), Störungen des Verdauungstraktes (Fütterungsstörungen im Säuglingsalter, Gedeihstörung, Erbrechen, Verstopfung und Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüre). Wir vermuten, dass Punktmutationen im hCRT-1-Gen die Proteinfaltung beeinträchtigen und folglich CTD verursachen können, da auch die Fehlfaltung anderer SLC-6- Transporter ursächlich für viele Störungen sein kann, beispielsweise können Mutationen im menschlichen Dopamin-Transporter (hDAT) die Entwicklung eines infantilen/juvenilen Dystonie- Parkinson-Syndroms verursachen. Bislang konnten im hCRT-1-Gen Dutzende natürlich vorkommende Mutationsvarianten identifiziert werden, die mit einem CTD assoziiert werden. Auffällig ist hierbei, dass in vielen Fällen Mutationen in äquivalenten hochkonservierten Sequenzen bei verschiedenen SLC-6-Proteinen zu fehlerhaften Transporterproteinen führen; z.B. existiert eine Punktmutation, die einen schlaflosen Phänotyp im DAT von Drosophila melanogaster (dDAT-G108Q) sowie eine schwere geistige Retardierung bei Jungen verursacht, in der äquivalenten Position im hCRT-1 (hCRT-1-G132V). Ähnlich ist es im Fall der P554L-Mutation: Im hDAT führt P554L zu Parkinsonismus, während die gleiche Mutation im hCRT-1-Gen eine schwere geistige Retardierung sowie eine pharmakoresistente Epilepsie verursacht. Unser Ziel ist es, die bekannten klinisch relevanten hCRT-1-Varianten zu untersuchen und zu beurteilen, ob die genannten Phänotypen aus einer defekten Faltung des hCRT- 1-Proteins entstehen. Mittels Pharmacochaperoning wurde versucht, fehlerhaft gefaltete Versionen vom Dopamin- und Serotonintransporter (SERT) funktionell wiederherzustellen (zu retten). Dies gelang bereits beim dDAT-G108Q sowohl in vitro in HEK293-Zellen als auch in vivo in Fliegen. Unsere vorläufigen Daten zeigen, dass hCRT-1-G132V (Mutation von Glycin äquivalent zu G108 im dDAT) im Gegensatz zum Wildtyp hCRT-1, der die Plasmamembran von HEK293-Zellen erreicht, im endoplasmatischen Retikulum (ER) vollständig zurückgehalten wird. Wir planen daher, die Details im Ablauf des Faltprozesses im hCRT-1 Wildtyp zu entschlüsseln, um zu verstehen, wie eine fehlerhafte Faltung entsteht und schließlich ob und wie Defekte in Transporterfaltung und funktion durch pharmakologische und/oder chemische Chaperone gerettet werden können. Diese Daten könnten wichtige Informationen liefern, die in Zukunft neue Therapien für Patienten mit CTD ermöglichen.

Genetische Mutationen in der codierenden Sequenz des menschlichen Kreatin-Transporters 1 (hCRT-1) wurden direkt mit dem Syndrom des Kreatin-Transporter-Mangels (CTD) in Verbindung gebracht. CTD umfasst eine Reihe von mäßigen bis schweren Störungen, darunter Epilepsie, geistige Retardierung, Autismus, psychomotorische Entwicklungsretardierung, Verhaltensauffälligkeiten (Hyperaktivität, Schüchternheit, stereotypisches aggressives und selbstverletzendes Verhalten), Motorische Dysfunktion (steifer Gang, leicht erhöhte Reflexe, Koordinationsschwierigkeiten und Dystonie), Störungen des Verdauungstraktes (Fütterungsstörungen im Säuglingsalter, Gedeihstörung, Erbrechen, Verstopfung und Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüre). Wir entdeckten, dass die Mehrheit der CTD-assoziierten Mutationen die Faltung des hCRT-1-Proteins beeinträchtigte. Wir setzten Pharmacochaperoning ein, um faltungsdefiziente Versionen von hCRT-1, die im Kompartiment des endoplasmatischen Retikulums (ER) zurückgehalten wurden, funktionell zu retten, im Gegensatz zum Wildtyp-Transporter, der korrekt auf die Plasmamembranen von Zellen ausgerichtet war. Die Behandlung mit dem renommierten chemischen Chaperon 4-Phenylbutyrat (4-PBA) stellte den ER-Export, die Zelloberflächenexpression sowie die Kreatinaufnahme durch viele der fehlgefalteten Krankheitsvarianten von hCRT-1 effizient wieder her. Unsere neuartigen Daten liefern einen Grundsatznachweis dafür, dass CTD-Mutanten gerettet werden können, und rechtfertigen die Suche nach zusätzlichen kleinen Molekülen mit therapeutischem Potenzial bei der Behandlung vieler von CTD betroffener Kinder.