3D-Pathologie von menschlichen Tumoren mit light-sheet Mikroskopie

Wir wollen ein mikroskopisches Verfahren entwickeln, daß eine 3 dimensionale Beurteilung der Histologie pathologischer Präparate von menschlichem Tumorgewebe erlaubt. Bislang werden die bei Krebsoperationen entnommenen Tumore in der Pathologie anhand von dünnen histologischen Schnitten untersucht um z.B. sicher zu gehen, daß der Tumor vollständig entfernt wurde. Wegen des Arbeitsaufwandes bei der Herstellung und Beurteilung der histologischen Schnitte muß sich der Pathologe bei größeren Tumoren im allgemeinen mit einer begrenzten, stichprobenartigen Anzahl von Schnitten begnügen. Bei der von uns entwickelten light-sheet Mikroskopie geklärter Präparate ist es dagegen möglich, rasch viele tausende von optischen Schnitte zu erhalten. Dazu wird das Gewebe aus der Pathologie mit einem schnellen chemischen Verfahren geklärt, also durchsichtig gemacht, wobei beim vorhergehenden Fixierungsprozess die Autofluoreszens des Gewebes stark erhöht wurde. Im Mikroskop wird dann der durchsichtige Tumor von der Seite mit einem sehr dünnen Lichtblatt durchleuchtet, so daß von oben die einzelnen optischen Schnitte durch das Mikroskopobjektiv aufgenommen werden können. Wenn das Präparat nun von unten in sehr kleinen Schritten durch das Lichtblatt geschoben wird, können in schneller Folge tausende optische Schnitte des Tumors mit einer hochauflösenden Kamera registriert werden. In diesen Schnitten sind die einzelnen Zellen durch ihre Autofluoreszens klar zu erkennen. Wir konnten durch den Vergleich mit den üblichen histologischen Färbungen schon zeigen, daß wir so bei Dickdarmkrebs normales- von Tumorgewebe klar unterscheiden können. Zudem lassen sich im Computer sehr leicht 3D- Rekonstruktionen von Tumoren mit zellulärer Auflösung erstellen. Diese 3D-Rekonstruktionen dürften in Zukunft den Pathologen die sichere Beurteilung von Tumoren erheblich erleichtern. Zusammen mit der Erfassung tausender optischer Schnitte sollte sich so die Schnelligkeit und Sicherheit der Beurteilung von Tumoren, die während Krebsoperationen entfernt werden, wesentlich erhöhen.

Ziel des Projektes war, eine Methode zu entwickeln um menschliche Turmorpräparate mit zellulärer Auflösung in 3D aufzunehmen und so zu einer sichereren und geanueren Krebsdiagnostik zu kommen. Dies ist uns auch mit der Entwicklunge eines schellen Klärverfahrens gelungen. Die Aufnahmen wurden mit der sogenannten Lichtblattmikroskopie gemacht, wobei die durchsichtig gemachten Tumorstücke von der Seite mit einem sehr dünnen Lichtblatt durchleuchtet werden, sodass sie von oben mit einem Mikroskop aufgenommen werden können. Dabei entstehen optische Schnitte, ohne dass das Präparat zerschnitten werden müsste. Aus diesen optischen Schnitten wird dann im Computer eine 3D Rekonstruktion des Tumors zusammen gesetzt und kann anschliessend vom Pathologen zur Krebsdiagnostik verwendet werden. Damit kann er tausende von optischen Schnitten für seine Diagnostik heranziehen, während in der konventionellen Histologie meistens nur ein 4 m dicker Schnitt alle 5 mm ausgewertet wird. Hinzu kommt noch, dass mit unserem Verfahren auch eine Aussage über die 3 dimensionale Struktur des Tumorgewebes gemacht werden kann, was bei der bisherigen Routinediagnostik nicht möglich war. Wir denken deshalb, dass unser Verfahren der 3D Pathologie in Zukunft zunehmend eingesetzt werden wird. Entscheidend für den Erfolg des Projekts war, dass wir ein schnelles chemisches Verfahren zur Enwässerung der Präparate entwickeln konnten, das die Entwässerung innerhalb weniger Stunden erlaubte, wärend bisherige clearing Verfahren of Wochen brauchten, aufgrund der hohen Zelldichte in Tumoren. Ausserdem waren unsere Entwicklungen für die Opitk der Lichtblattmikroskopie wichtig, da wir damit sehr dünne Lichtblätter erzeugen konnten um zu einer guten Auflösung in axialer Richtung im Präparat zu kommen. Desweiteren haben wir auch Frabstoffe identifiziert, deren Fluoreszenz auch bei organischer Gewebeklärung erhalten bleibt. Damit konnten wir Zellkerne und Zytoplasma spezifisch anfärben und mit einem von uns entwickelten Computerprogramm in die, den Pathologen geläufigen HE Farben zu transformieren. Damit können Sie die so gewonnen 3D Bilder direkt zur pathologischen Diagnostik nutzen. Da wir auch einen klärungsresistenten Farbstoff für Blutgefässe identifizieren konnten, kann man mit unserem Verfahren auch eine Aussage über die Blutversorgung des Tumors machen. Dies ist besonders wichtig, da so das Ausmass der Neovaskularisation beurteil werden kann, was für die Prognose von besonderer Bedeutung ist, aber bisher nicht darstellbar war.