Regulation der ES Zelldifferenzierung durch NMD

Man kann sich die Entwicklung von höheren eukaryotischen Organismen als ein reguliertes, schrittweises Durchlaufen von Zellidentitäts-Entscheidungen vorstellen. Dies verläuft unidirektional, sowie, mit der Ausnahme von pathologischen Ereignissen, unumkehrbar ab. Die Innere Zellmasse sowie embryonale Stammzellen können in alle embryonalen Zelltypen ausdifferenzieren; diese Eigenschaft nennt man Pluripotenz. Obwohl in den letzten Jahren große Fortschritte im Verständnis von Pluripotenz erzielt wurden, bleiben die genauen molekularen Mechanismen und deren Wirkungsweise in der Regulation von Differenzierung und Zellidentitäts-Entscheidungen unbekannt. Ein Verständnis für diese Prozesse ist die Grundlage für die effiziente Nutzung von embryonalen Stammzellen in der regenerativen Medizin. In genetischen screens mit haploiden embryonalen Stammzellen wurde eine Kohorte an Kanidaten- Genen identifiziert, die in der Differenzierung von embryonalen Stammzellen eine wichtige Rolle spielen. Einer der identifizierten Prozesse ist der sogenannte Nonsense Mediated mRNA Decay (NMD). Das ist ein Mechanismus der das RNA Gleichgewicht in der Zelle aufrechterhält. NMD erkennt potenziell schädliche RNA Moleküle und führt sie Abbaumechanismen zu. Um die Funktion von NMD in ES Zellen zu studieren, haben wir ES Zell Linien hergestellt, in denen mehrere NMD Faktoren genetisch zerstört wurden. Diese zeigen, wie erwartet, einen starken Differenzierungsdefekt. Allerdings beobachten wir auch unerwartete Unterschiede sowohl in der phänotypischen Ausprägung und Stärke dieser Defekte sowie in der Amplitude der Gen- Deregulierung zwischen unterschiedlichen KO Zellinien. Welche deregulierten mRNAs genau für den Differenzierungsdefekt verantwortlich sind, ist bisher unbekannt. Um diese zu identifizieren, werden wir mehrere komplementäre Experimente durchführen. Diese werden sowohl die biochemische Analyse von mRNA Halbwertszeiten, sowie next generation sequencing basierter Transkriptomanalysen umfassen. Ebenso planen wir die Durchführung eines genetischen screens der darauf abzielt die primären Targets der NMD Regulation zu identifizieren. Die Durchführung in 3D-Zellkulturmodellen wird durch die Verfügbarkeit eines large-particle Sorters ermöglicht. Unsere Arbeit wird einerseits zu einem besseren Verstaendnis der Mechanismen, welche fuer die Erhaltung und die Etablierung von Zellidentität verantwortlich sind führen. Wir werden weiters die Konservierung zentraler Mechanismen in Maus Modellen, sowie in humanen embryonalen Stammzellen evaluieren.

Die Entwicklung von höheren eukaryotischen Organismen kann als ein reguliertes, schrittweises Durchlaufen von Zellidentitäts-Entscheidungen beschrieben werden. Diese basieren auf dem gelzielten Ausschalten der Gene die den einen Zellzustand definieren und dem Anschalten eines neuen Genexpressionsmusters das charakteristisch für die neue Zellidentität ist. Eine Möglichkeit das zu erreichen ist, neben der direkten Regulation der Transkription, die Kontrolle von mRNA-Stabilität. In unserer Arbeit zeigen wir eine Rolle eines der Hauptregulationsmechanismen für RNA-Stabilität - nonsense mediated mRNA decay, kurz NMD - in der Differenzierung von embryonalen Stammzellen. Wir finden, dass NMD eine spezifische Isoform eines Translationsinitiationsfaktors, Eif4a2, reguliert. Die Misregulation in NMD defizienten embryonalen Stammzellen führt zu ausgeprägten Problemen beim Verlassen des Stammzellzustandes während der Differenzierung. Diese Probleme sind auf eine Misregulation der Proteinsynthese in NMD defizienten Zellen zurückzuführen. Zusammenfassend zeigt unsere Arbeit einen Zusammenhang zwischen RNA Homöostase und Translationsaktivität, die für ein normales Differenzierungsverhalten von pluripotenten Stammzellen essenziell ist.