Charakterisierung des neuen LETM1 Interaktionspartner TMBIM5

Mitochondrien sind lebenswichtige Organellen die unsere Zellen mit Energie versorgen. Andere Schlüsselfunktionen der Mitochondrien sind die Regulierung der zellulären Ionenhomöostase und die Entscheidung über den Zelltod. Funktionsstörungen der Mitochondrien können schwerwiegende Folgen haben und Erkrankungen verursachen wie Neurodegenerationen, metabolische Krankheiten oder Krebs. Daher sind Gene die für den Erhalt von mitochondriellen Funktionen sorgen von ebenso entscheidender Bedeutung. LETM1 ist eines dieser essentiellen Gene und kodiert für ein Protein der mitochondriellen Innenmembran. Die verringerte Genfunktion steht im Zusammenhang mit der Epilepsieerkrankung im Wolf Hirschhorn Syndrom. Das LETM1 Protein reguliert das Volumen der Mitochondrien indem es ein Gleichgewicht der inneren osmotischen Kationen regelt. LETM1 wurde von mehreren Forschungsgruppen als wesentlicher Bestandteil eines Kationen Protonen Ausstauschers charakterisiert. Jedoch wird heftig darüber debattiert, ob LETM1 das osmotische Kalium, oder eher Kalzium, gegen Protonen transportiert. Unklar bisher ist auch die Vorstellung wie LETM1 mit 1-2 Transmembranregionen ein Membrankanal formen soll. Daher wurde angenommen, dass LETM1 entweder ein Proteinkomplex mit sich selbst oder mit anderen noch unbekannten Proteinen bildet. Um dies herauszufinden suchten wir nach Proteininteraktionspartnern und identifizierten und bestätigten TMBIM5 als neuen LETM1 Interaktionspartner. In diesem Antrag schlagen wir vor, genau zu untersuchen ob beide Proteine ihre Funktion über ihre Interaktion definieren: Z.B ob das eine als regulatorische Untereinheit und das andere Transporter fungiert. Oder ob beide unterschiedliche Transportfunktionen haben, je nachdem ob sie ein Proteinkomplex bilden oder nicht. Um herauszufinden, welche Funktionen von der Interaktion abhängig ist, möchten wir eine ganze Reihe von LETM1 und TMBIM5 Proteinmutanten herstellen und in ihre Transportaktivität und Proteininteraktion analysieren. Die Untersuchungen sollen an ganzen Zellen, isolierten Organellen und zellfreien Systemen erfolgen. Ergebnisse der vorgeschlagenen Untersuchungen sollen aufdecken, ob TMBIM5 der mitochondrielle Ca2+/H+ Antiporter ist, und LETM1 an dessen Regulierung beteiligt ist. Mit diesen Erkenntnissen könnte zum ersten Mal die molekulare Identität des lang gesuchten Ca2+/H+ Antiporters sowie die umstrittene Funktion von LETM1 klargestellt werden.

Mitochondrien spielen bei den Zellfunktionen eine zentrale Rolle, die über ihr traditionelles Image als Energiekraftwerke hinausgeht. Diese Organellen dienen als lebenswichtige Stoffwechselknotenpunkte, die an der Genexpression, an Immunreaktionen und an vielen anderen für das Wohlbefinden des Organismus wichtigen Prozessen beteiligt sind. Um funktionelle und dynamische Mitochondrien aufrechtzuerhalten, ist eine strenge Regulierung der Volumen- und Kationenhomöostase von entscheidender Bedeutung. Das Zusammenspiel von Transportsystemen und dem bioenergetischen Zustand steuert diese Prozesse. Die mitochondriale K+-Homöostase ist wesentlich für die osmotische Integrität und hängt stark von der Aktivität des K+/H+-Austauschers (KHE) ab, der durch LETM1 vermittelt wird. In ähnlicher Weise reguliert die Ca2+-Homöostase in den Mitochondrien die Signaltransduktion und den Stoffwechsel, und eine übermäßige Ca2+-Überladung wird durch Na+-abhängige und unabhängige Transportsysteme verhindert. Obwohl viele mitochondriale Akteure des K+- und Ca2+-Transports bekannt sind, ist die Identität des Ca2+/H+-Austauschers (CHE) ein fehlendes Teil in diesem molekularen Puzzle geblieben. Im Rahmen unseres Forschungsprojekts wurde die physikalische Interaktion zwischen LETM1 und TMBIM5, einem Mitglied der Proteinfamilie, die am intrazellulären Ca2+-Handling beteiligt ist, identifiziert. Aufbauend auf dieser Entdeckung lag unser Hauptaugenmerk darauf, die Funktion von TMBIM5 bei der mitochondrialen Kationenregulierung und sein Zusammenspiel mit LETM1 zu klären. Um unsere Forschungsziele zu erreichen, setzten wir eine Reihe von komplementären Ansätzen ein, darunter genetische Knockouts, Ca2+- und K+-Transport-Assays in intakten und permeabilisierten Zellen, in isolierte Mitochondrien und zellfreie Assays mit Proteoliposomen. Dank dieser Ansätze, die durch die Zusammenarbeit mit Experten unterstützt wurden, konnten wir die Funktionen von TMBIM5 gründlich untersuchen. Ein wichtiger Meilenstein in unserem Projekt war die Identifizierung von TMBIM5 als der lang gesuchte mitochondriale CHE. Diese entscheidende Entdeckung warf ein neues Licht auf die kontroverse Debatte um die Rolle von LETM1 als mutmaßlicher CHE und lieferte Einblicke in die Rückkopplungsschleife zwischen mitochondrialer Ca2+-Homöostase, ATP-Stoffwechsel und Zelltod, bei der TMBIM5 eine entscheidende Rolle spielt. Unsere Ergebnisse heben die Bedeutung von TMBIM5 bei der Aufrechterhaltung der mitochondrialen Bioenergetik, der Architektur der Cristae und der Kontrolle der Permeabilitätsporenübergänge hervor. Darüber hinaus untersuchten wir mit Hilfe von Mutationsanalysen die Zusammenhänge zwischen dem mitochondrialen KHE und CHE sowie die Proteinkomplexbildung zwischen LETM1 und TMBIM5. Durch die Entschlüsselung der molekularen Identität des mitochondrialen CHE bringt unser Forschungsprojekt den Bereich der mitochondrialen Forschung voran und bietet spannende Perspektiven für zukünftige Untersuchungen. Die im Rahmen dieser Studie gemachten Entdeckungen vertiefen nicht nur unser Verständnis der mitochondrialen Physiologie, sondern ebnen auch den Weg für die Erforschung der klinischen Auswirkungen der durch LETM1- und TMBIM5-Mutationen verursachten Dysregulation mitochondrialer Kationen. Diese Forschung trägt zu den umfassenderen Bemühungen bei, die komplizierten Mechanismen der Kationenhomöostase, die die mitochondrialen Funktionen und ihre Auswirkungen auf die zelluläre und organismische Gesundheit steuern, zu erforschen.