ATP/ADP-Translokase und mitochondrialer Protonen-Leak

Der Adeninnukleotid-Translokase (ANT) ist das häufigste Protein der inneren mitochondrialen Membran. Zusätzlich zu seiner Hauptfunktion dem Austausch von ATP gegen ADP trägt der ANT offensichtlich auch zu der erhöhten Durchlässigkeit der mitochondrialen Membran für Protonen (Protonen-Leak) bei. Im Gegensatz zum Entkopplerprotein 1 (UCP1)-vermittelten Protonen-Leak, der für die nicht zitternde Wärmeproduktion ausschlaggebend ist, sind die Bedeutung, das Ausmaß und die Steuerungsmechanismen des durch den ANT-vermittelten Protonentransports noch nicht erforscht. Zum ersten Mal werden hoch aufgereinigte rekombinante Proteine (ANT1-ANT3) und deren Mutanten in ebenen Bilipid-Membranen untersucht. Solche Membranen bieten die einzigartige Möglichkeit, die hohen Transmembranpotenziale, die für die arbeitenden Mitochondrien typisch sind, direkt anzuwenden. Wir werden zwei Hypothesen untersuchen, die besagen, dass Protonen entweder durch die zentrale Öffnung im Protein entweichen können oder durch Fettsäuren (FA) transportiert werden, wobei der ANT die negativ geladene FA (ähnlich zu den UCPs) zurücktransportiert. Im Einzelnen werden wir folgende Fragenstellungen untersuchen: (i) die Transportraten für den ANT aus verschiedenem Gewebe (ANT1-ANT3) und deren Mutanten, (ii) die Voraussetzungen zur Aktivierung und Hemmung des ANT-vermittelten Protonentransports, (iii) die Rolle der Membranlipidzusammensetzung, des transmembranen Potentials und des pHs in der Steuerung der ANT-vermittelten Protonenleitfähigkeit und (iv) das Zusammenspiel zwischen dem ATP/ADP-Austausch und dem H+-Transport. Es wird der ANT-Beitrag zur hemmstoffsensiblen Membrandurchlässigkeit für Protonen ausgewertet, in dem die Leitfähigkeit eines Einzelprotons mit dem von mitochondrialen UCPs verglichen wird. Das endgültige Ergebnis wird ein genaues Verständnis des Proton-transportierenden Mechanismus des ANTs sein, sowie der ANT-Rolle im gesamten mitochondrialen Protonen-Leak. Dieses Verständnis ist wichtig, um neue pharmakologische Konzepte für die Behandlung verschiedener Krankheiten wie vor allem Fettleibigkeit, Krebs, Herz- und neurodegenerative Krankheiten zu entwickeln.

Mitochondrien sind gut bekannt als Energie-Kraftwerke der Zellen. Deren Hauptfunktion ist die Produktion von Energiespeicher der Zelle - ATP. Während ATP durch die Proteine der Atmungskette hergestellt wird, übernimmt Adeninnukleotidtransporter (ANT) den Austausch des ATP gegen ADP. ANT ist das am häufigsten vorkommende Protein in der inneren Mitochondrienmembran, und dessen Fehlfunktion führt zu schweren Myopathien oder Ophthalmoplegie. Neben seiner Haupttransportfunktion transportiert ANT vermutlich auch Protonen und trägt damit zum Protonenleck in den Mitochondrien bei. Im Gegensatz zum uncoupling protein 1 (UCP1), das für die zitterfreie Thermogenese unerlässlich ist, sind weder die Bedeutung, noch das Ausmaß, noch die Regulierung des durch ANT vermittelten Protonentransports bekannt. In diesem Projekt untersuchten wir die protonophorische Aktivität von ANT1 und ANT1-Mutanten, die in E. coli produziert und in planare Doppelschichtmembranen eingebaut wurden. Der Vergleich der Einzelmolekül-Protonenumsatzzahl von ANT mit der von UCPs unter Berücksichtigung der Häufigkeit des Proteins zeigt die hohe Bedeutung von ANT für proton leak. Das Hauptziel des Projekts bestand darin, zwischen zwei Hypothesen zu unterscheiden. Nach der ersten Hypothese entweichen Protonen in Gegenwart oder Abwesenheit von langkettigen Fettsäuren (FA) durch den zentralen Hohlraum von ANT. Die zweite Hypothese postuliert, dass neutral FA spontan transportiert werden, während ANT das FA-Anion in die entgegengesetzte Richtung transportiert. Um diese Hypothesen zu testen haben wir (i) die Proton-Transportraten von ANT1 und ANT-Mutanten mit veränderten Protonenbindungsfähigkeiten gemessen, (ii) Aktivatoren und Inhibitoren des ANT-vermittelten Proton-Transports identifiziert, (iii) untersucht, wie die Membranlipidzusammensetzung die ANT-vermittelte Protonen-Leitfähigkeit beeinflusst, und (iv) die Rolle des Proton-Transports für den ATP/ADP-Austausch aufgeklärt. Um den Mechanismus zu testen, durch den ANT1 Protonen transportiert, haben wir Leitfähigkeitsmessungen von Doppelschichtmembranen, mit Molekulardynamik-Simulationen kombiniert. Wir haben gezeigt, dass ein polarer FA-Kopf entlang der äußeren, positiv geladenen Proteinoberfläche gleitet, während FA-Acylketten sich in dem hydrophoben Kern der Doppelschicht bewegen. Die ATP-Bindung an positiv geladene Aminosäure Arginin 79 im Inneren des Proteins verringert das positiv geladene elektrische Feld und hemmt dadurch den FA-Anionentransport. Wir haben demonstriert, dass Arginin 79 auch für die kompetitive Bindung von ADP, ATP und Inhibitoren (Carboxyatractylosid und Bongkrekinsäure) entscheidend ist. Die Ergebnisse, die wir an ANT bekommen haben sind wichtig für die andere Proteine, da die mutmaßlichen Bindungsstellen unter den mitochondrialen SLC25-Mitgliedern konserviert sind. Das weisst auf einen allgemeinen Mechanismus für den Transport von FA-Anionen durch die innere Mitochondrienmembran hin. Unsere Ergebnisse liefern eine Erklärung für den Beitrag von ANT zum Entkopplungseffekt in Mitochondrien und sind für das Verständnis (i) des durch andere Entkoppler-Proteine vermittelten Protonentransportmechanismus und (ii) des durch Flippasen und Scramblasen vermittelten Lipid-/Fettsäuretransports durch biologische Membranen von wesentlicher Bedeutung. Das detaillierte Verständnis des Protonentransportmechanismus von ANT und seines Beitrags zum mitochondrialen Protonenfluss eröffnet neue Perspektiven für die Entwicklung von Arzneimitteln und therapeutischen Anwendungen, z. B. gegen Fettleibigkeit, Krebs und neurodegenerative Erkrankungen.