FAHD1 als neuer Regulator der Mitochondrienfunktion

Das Projekt FAHD1 als neuer Regulator der Mitochondrienfunktion befasst sich mit molekularen Mechanismen der Regulation der Mitochondrienfunktion durch die Oxaloacetat- Decarboxylase (ODx) FAHD1. Es soll untersucht werden, ob die katalytische Aktivität von FAHD1 für die Regulation der Mitochondrienfunktion von Bedeutung ist. Dabei soll auch der postulierte Mechanismus für die katalytische Aktivität von FAHD1 experimentell validiert werden. Im zweiten Teil des Projektes sollen kleine Moleküle als neue Inhibitoren von FAHD1 hergestellt und validiert werden; in der Folge soll geprüft werden, ob pharmakologische Inhibition von FAHD1 in menschlichen Zellen die Mitochondrienfunktion regulieren kann und ob durch derartige Wirkstoffe das Wachstum von Tumorzellen gehemmt werden kann. Zur Klärung der o.g. Fragen sollen durch gezielte Mutagenese Varianten von FAHD1 hergestellt werden, welche eine verringerte Aktivität in Bezug auf die Decarboxylierung von OAA bzw. die Hydrolyse von Acylpyruvaten aufweisen. Derartige Mutanten von FAHD1, basierend auf der vor kurzem etablierten hoch auflösenden Struktur des katalytischen Zentrums von FAHD1, sollen in Bakterien exprimiert und ihre Aktivität als ODx bzw. Acylpyruvat-Hydrolase (ApH) in vitro bestimmt werden. FAHD1-Varianten sollen dann in menschlichen Zellen darauf getestet werden, ob die durch die Inaktivierung des endogenen FAHD1-Gens reduzierte Mitochondrienfunktion durch Überexpression von geeigneten Mutanten wiederhergestellt werden kann. Für die Identifizierung von pharmakologischen FAHD1-Inhibitoren sollen neue Substanzen synthetisiert und darauf getestet werden, ob sie eine verbesserte Inhibitorwirkung auf FAHD1 ausüben. Die wirksamsten Inhibitoren sollen dann im Komplex mit FAHD1-Protein kristallisiert und die Struktur der resultierenden Inhibitor/Enzym-Komplexe über Röntgenstrukturanalyse aufgeklärt werden. Davon versprechen wir uns entscheidende Hinweise für das Design der nächsten Generation von FAHD1 Inhibitoren, welche wieder über eine Kombination von Enzym-Inhibitionstest und Affinitätsmessung charakterisiert werden. Die besten FAHD1 Inhibitoren, idealerweise wirksam im niedrigen nanomolaren Bereich, sollen dann eingesetzt werden, um FAHD1 in Tumorzellen pharmakologisch zu inhibieren, gefolgt von einer Analyse der Mitochondrienfunktion und einer Analyse von Wachstum und Überleben der Tumorzellen. Die Innovation in dem Projekt beruht einerseits auf dem Nachweis, dass die Fähigkeit von FAHD1, zur Regulation der Mitochondrienfunktion auf seiner katalytischen Aktivität beruht, und ob dafür die ApH- oder ODx-Aktivität von FAHD1 benötigt wird. Zudem kann der von uns postulierte katalytische Mechanismus der Decarboxylierung von Oxalacetat durch FAHD1 experimentell verifiziert werden. Ein weiterer innovativer Aspekt des Projekts besteht in der Entwicklung von neuartigen FAHD1-Inhibitoren und potenziellen Anwendungen derartiger Inhibitoren als neue Wirkstoffe zur Hemmung des Wachstums von Tumorzellen.

In dem Projekt wurde die Struktur und Funktionsweise des Proteins FAHD1 aufgeklärt, einer neuartigen Oxalacetat-Decarboxylase. Insbesondere wurde durch Röntgenstrukturanalyse die Struktur des aktiven Zentrums des Enzyms analysiert; durch gezielte Mutation einzelner Aminosäuren im aktiven Zentrum und anschließende Funktionsanalyse konnten die molekularen Mechanismen aufgeklärt werden, über die das Enzym einerseits die Decarboxylierung von Oxalacetat und andererseits die Hydrolyse von Acylpyruvaten katalysiert. Aufbauend auf dieser Analyse wurde auch eine erste Generation von FAHD1-Inhibitoren identifiziert und weiterentwickelt. Ausgehend von präliminären Daten, wonach FAHD1 in Brustkrebszellen überexprimiert ist, wurde in Kooperation mit der Universität von Porto (Portugal) nachgewiesen, dass FAHD1 in auch im Gewebe von Brustkrebspatientinnen überexprimiert ist. Brustkrebszellen lassen sich nach ihrer Herkunft einteilen in den luminalen bzw basalen Zelltyp, wobei der basale Zelltyp, auch als triple-negativ bezeichnet, deutlich schwerer zu therapieren ist. Die Hypothese, dass die Expression von FAHD1 für das Überleben derartiger Tumorzellen wichtig ist, wurde getestet. Einerseits wurde die Expression von FAHD1 in Brustkrebszelllinien analysiert; hierbei ergab sich, dass FAHD1 sowohl in luminalen als auch in basalen Brustkrebszelllinien exprimiert ist. Durch genetische Inaktivierung von FAHD1 in Brustkrebszellen konnte die Proliferation dieser Zellen beeinflusst werden. Interessanterweise führt die Inaktivierung von FAHD1 in luminalen (z.B. MCF-7) Zellen zur Inhibition der Zellproliferation, abhängig von den im Medium vorhandenen zu Nährstoffen, insbesondere Glutamin. Auf der anderen Seite ist das Überleben von Brustkrebszellen des basalen Typs (z.B. BT-20) mit der Inaktivierung von FAHD1 nicht vereinbar; diese Zellen sterben ab. Im Projekt wurde auch der Mechanismus identifiziert, über den FAHD1 die Proliferation von Brustkrebszellen hemmt. Der primäre Effekt der FAHD1-Inaktivierung besteht in einer partiellen Inaktivierung von Komplex II der mitochondrialen Atmungskette, basierend auf der Akkumulation von Oxalacetat in der Mitochondrienmatrix. Über derzeit noch nicht genau bekannte Vorgänge führt dies zu einer verringerten Menge des Schlüsselenzyms Glutaminase, welches für die stark glutaminabhängigen Tumorzellen aus Brustkrebs essentiell ist. Damit wurde eine neue therapeutische Option identifiziert, um die Proliferation von Tumorzellen, insbesondere triple-negativen Brustkrebs Zellen, zu inhibieren. Schließlich wurden kleine Moleküle identifiziert und synthetisiert, welche die Aktivität von FAHD1 inhibieren, derzeit noch im niedrigen mikromolaren Bereich. Aus unserer Sicht lässt sich durch weitere Entwicklung dieser Moleküle eine neue therapeutische Strategie für Patientinnen mit Brustkrebs ableiten, welche in zukünftigen Studien untersucht werden soll.