Hatchet Ribozyme

Erst kürzlich wurden vier neue selbst-spaltende Ribozym-Klassen entdeckt, die als Twister, Twister-Sister, Pistol und Hatchet bezeichnet werden. Drei von ihnen (Twister, Twister-Sister und Pistol) wurden von verschiedenen Forschungsgruppen (einschließlich uns) aus unterschiedlichen Perspektiven untersucht, was zu einem grundlegenden, wenn auch noch unvollständigen molekularen Verständnis der Funktionsweise dieser Ribozyme führte. Eine Klasse jedoch, jene der Hatchet Ribozyme, blieb vernachlässigt und die Geheimnisse ihrer Struktur und ihres Mechanismus sind noch immer nicht bekannt. Hatchet-Ribozyme werden wegen ihrer offensichtlichen strukturellen Flexibilität in Bezug auf Strukturaufklärung und Wirkungsweise herausfordernd sein. Der für dieses Projekt entwickelte multidisziplinäre Ansatz kann ein derart komplexes Problem in der RNA- Forschung angehen und lösen: Unser Unterfangen basiert auf maßgeschneiderten, chemisch modifizierten RNAs und wendet eine breite Palette von Methoden an, die von klassischen bis hin zu hochmodernen Techniken reichen. Das Ziel dieses Projekts ist die Aufklärung der Prinzipien, die der Katalyse chemischer Reaktionen in konformativ flexiblen, hochdynamischen RNA-Systemen zugrunde liegen, und zwar am Beispiel der Hatchet-Ribozyme. Wir werden dieses Ziel erreichen, indem wir die Stärke der organischen Synthese (Synthese von modifizierten Nukleosiden; Synthese von ortsspezifisch markierter RNA durch Festphasensynthese), der Biochemie (atomspezifische Mutagenese und Nukleosid-Mutagenese; selektive 2`-Hydroxylacylierung durch Primer Extension (SHAPE) Analyse), und der Biophysik (Röntgenkristallographie; Einzelmolekül- Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (smFRET)und Relaxationsdispersion-NMR Spetroskopie) nutzen. Mit diesem kombinierten Ansatz werden wir in der Lage sein, ein bisher nicht gekanntes Verständnis für die Strukturdynamik-gesteuerten Konzepte zu erlangen, die für die Reaktivität von Hatchet-Ribozyme gelten. Die strukturelle Flexibilität dieser Ribozyme erinnert an intrinsisch ungeordnete Proteine (IDPs), die an einer Reihe von Krankheiten beteiligt sind und die für das Verständnis der molekularen Erkennung durch Proteine entscheidend sind. Das Erforschen der Dynamik von RNA treibt nicht nur die RNA-Forschung im Allgemeinen vorwärts, sondern ist auch wesentlich für den Fortschritt in der Biomedizin, wie die Entwicklung kleiner Moleküle (z.B. Ribocil, Branaplam), die an therapeutische RNA- Ziele binden. Ein detailliertes Verständnis darüber,wie Strukturdynamik RNA- Spaltungsstellen-Erkennung und RNA-Katalyse bestimmt, wird sicherlich auch entscheidende Implikationen für zukünftige RNA-Medikamentenentwicklung haben.

Zum Verständnis von Ribozymen - Von der chemischen Synthese und Kristallographie bis zur Fluoreszenz (FRET) und NMR-spektroskopischen Analyse: Vier neue selbstspaltende Ribozymklassen, die als Twister, Twister-Sister, Pistol und Hatchet bezeichnet werden, wurden 2015 im Labor von Ronald Breaker (Yale) entdeckt. Eines von ihnen (Twister) wurde von verschiedenen Forschergruppen (einschließlich uns) aus unterschiedlichen Perspektiven untersucht, was zu einem grundlegenden, wenn auch noch unvollständigen molekularen Verständnis der Funktionsweise dieser Ribozymklasse führte. Drei weiter von ihnen, die Hatchet-, Twister-Sister-, und Pistol-Ribozyme, wurde bisher vernachlässigt und die Geheimnisse ihrer Struktur und ihres Mechanismus waren zu Projektbeginn noch nicht gelüftet worden. Diese Ribozyme stellen aufgrund ihrer offensichtlichen strukturellen Flexibilität eine Herausforderung für die Strukturaufklärung und die Wirkungsweise dar. Der multidisziplinäre Ansatz, der für dieses Projekt entwickelt wurde, kann ein solch komplexes Problem in der RNA-Forschung angehen: Unser Vorhaben basierte auf maßgeschneiderten, chemisch modifizierten RNAs und nutzte eine breite Palette von Methoden, die von klassischen bis hin zu hochmodernen Techniken reichen. Ziel dieses Projekts war es, die Prinzipien aufzuklären, die der Katalyse chemischer Reaktionen in konformationsflexiblen, hochdynamischen RNA-Strukturen zugrunde liegen, wobei Hatchet- und vor allem Pistol-Ribozyme, als Modelle dienten. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden Methoden der organischen Synthese (d.h. Synthese modifizierter Nukleoside; Synthese ortsspezifisch markierter RNA durch Festphasensynthese), der Biochemie (d.h. Atom-spezifische Mutagenese und Nukleosid-Mutagenese; Selektive 2`-Hydroxyl-Acylierung, analysiert durch Primer-Extension (SHAPE)) und der Biophysik (Röntgenkristallographie; Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) Spektroskopie; NMR Spektroskopie) genutzt. Mit diesem kombinierten Ansatz waren wir in der Lage, ein noch nie dagewesenes Maß an Verständnis für die von der Strukturdynamik angetriebenen Konzepte zu erlangen, die Ribozyme anwenden, um Reaktivität zu erreichen. Die strukturelle Flexibilität von Ribozymen erinnert an intrinsisch ungeordnete Proteine (IDPs), die bei einer Reihe von Krankheiten eine Rolle spielen und für das Verständnis der molekularen Erkennung von Proteinen von entscheidender Bedeutung sind. Die Erforschung der RNA-Dynamik fördert nicht nur die RNA-Forschung im Allgemeinen, sondern ist auch für den Fortschritt in der Biomedizin von entscheidender Bedeutung, etwa für die Entwicklung kleiner Moleküle (z. B. Ribocil, Branaplam), die an therapeutische RNA-Ziele binden. Ein detailliertes Verständnis darüber, wie die strukturelle Dynamik die Erkennung von RNA-Spaltstellen und die RNA-Katalyse bestimmt, wird sicherlich entscheidende Auswirkungen auf die künftige Entwicklung von RNA-Medikamenten haben.