Molekulare Evolution von Häm Peroxidasen aus Schädellosen

Die Häm Peroxidasen aus Cephalochordata (Schädellosen - Chordatiere) repräsentieren eine noch ganz unerforschte anzestrale Evolutionslinie die sich in weiteren Stufen zu Thyroid Peroxidasen aus Säugetieren entiwckelt hat. Wir haben vorher in einer phylogenetischen Studie gezeigt, dass die Häm Peroxidase Gene aus der Gattung Branchiostoma eine sehr hohe Sequenzhomologie mit bekannten Thyroid- und Lacto- Peroxidasen aus Wirbeltieren besitzen und laut Sequenzvergleich haben sie auch alle essentielle Aminosäuren-Reste in aktiven Zentren. Im vorliegenden Projekt werden wir die Struktur-Funktion Beziehungen dieser eigenartigen Peroxidasen von Urochordaten erforschen. Zuerst werden wir die native Expression bei verschiedenen physiologischen Konditionen mittels real-time PCR erforschen und den genomischen Inhalt von entsprechenden Genen genau untersuchen. In nächster Stufe werden wir die typische UVvis und ECD Spektren von rekombinant produzierten Branchiostoma belcheri & floridae Peroxidasen überprüfen. Mittels Massen Spektrometrie werden wir die für diese Superfamilie typische kovalente Verbindung zwischen der prostetischen Häm Gruppe und der Polypeptidkette analysieren. Später werden auch die katalytische Eigenschaften und der dominierende Reaktionsmechanismusdieser Oxidoreduktasen untersucht. Mit mehreren präzisen Methoden werden wir vor allem die Formierung von Hypoiodige Säure mit antibakterieller Wirkung die vermutlich durch diese Peroxidasen produziert werden kann untersuchen. Im Fokus wird besonders die Iodienierung von ausgewählten Modelsubstanzen stehen, die zur Formierung von Thyroxin und ähnlichen Hormonen führt. Unsere Resultate sollen dazu führen dass es möglich wird die hochgereinigte Peroxidasen aus Schädellosen Tieren als Modelsystem für die menschliche Thyroid Peroxidase zu verwenden von der die 3D struktur noch fehlt, weil ihre Produktion in grossen Mengen sehr problematisch ist. Zum Schluss werden wir versuchen die rekombinante Branchiostoma Peroxidasen zu krystallisieren um die enzymatische Iodinierung auf molekularer Ebene zu erforschen.

In diesem Forschungsprojekt wurden bioinformatische in-silico-Analysen durchgeführt, wobei der Schwerpunkt auf genomischem Data-Mining, Sequenzerhaltungsmustern und robuster phylogenetischer Rekonstruktion lag. Ein robuster phylogenetischer Baum von Peroxidasen aus der gesamten Peroxidase-Cyclooxygenase-Superfamilie wurde durch die Analyse von 620 Vollängensequenzen erstellt. Dies führte zur Entdeckung der besonderen Genarchitektur der vom Amphioxus-Genom kodierten Peroxidasen, die phylogenetisch zwischen Familie 1 und Familie 2 der Peroxidase-Cyclooxygenase-Superfamilie positioniert sind. Der Vergleich der entsprechenden Teile der Genome ergab ein komplexes evolutionäres Muster und zeigte, dass mutmaßliche Vertreter der Cephalochordaten-Peroxidasen evolutionär basal zu allen Thyroidperoxidasen der Vertebraten und auch zu allen Peroxidasinen sind. Der beste Vertreter der Cephalochordaten-Peroxidasen, die Peroxidase aus Branchiostoma belcheri, wurde heterolog in Pichia pastoris exprimiert und durch umfangreiche biophysikalische und biochemische Untersuchungen charakterisiert. Dieselben in-silco-Methoden wurden auch auf Hybrid-B-Häm-Peroxidasen und Glutathion-Peroxidasen angewandt. Dabei wurde eine neue Hybrid-B-Häm-Peroxidase als einzige Peroxidase im Sekretom des wichtigen phytopathogenen Pilzes Sclerotium cepivorum entdeckt und auf Proteomebene untersucht, und durch die Erstellung eines großen Glutathion-Peroxidase-Baumes konnten die evolutionären Beziehungen zwischen allen Phyla aufgeklärt werden. Die molekulare Phylogenie der Peroxygenasen, die als sehr vielseitige Biokatalysatoren bekannt sind, wurde ebenfalls rekonstruiert. Diese Oxidoreduktasen, die hauptsächlich zur Oxyfunktionalisierung fähig sind, bilden die Superfamilie der Peroxidase-Peroxygenasen. Die repräsentative Rekonstruktion ergab eine hohe Diversität, aber auch gut konservierte Sequenzmotive innerhalb relativ kurzer Proteinmoleküle. Entsprechende Gene, die für Peroxygenasen kodieren, wurden nur in wenigen niederen Eukaryoten gefunden. Die meisten Peroxygenasen stammen aus dem Reich der Pilze und insbesondere Clades, die einen sehr alten evolutionären Ursprung haben. Es gibt auch eine ausgeprägte Clade, der hauptsächlich von phytopathogenen Stramenopilen gebildet wird, in der sogar Peroxygenase-Sequenzen von Amöbozoen gefunden werden können. Die phylogenetisch älteren Peroxygenasen sind meist intrazellulär, aber die spätere Evolution brachte sekretorische Proteine, vor allem in pathogenen Pilzen hervor.