Mechanismus des bakteriellen Kollagenabbaus

Kollagene sind die am häufigsten vorkommenden Proteine in Säugern. Sie machen fast 25% des Gesamtproteingehaltes des Körpers aus und sind essentiell für die Aufrechterhaltung der Integrität unserer Gewebe. Sie können nur von wenigen spezialisierten körpereigenen Proteasen (Kollagenasen) prozessiert werden. Doch auch einige Bakterienspezies der Gattungen Clostridium und Bacillus haben Kollagenasen entwickelt. Diese bakteriellen Kollagenasen gehören zur Familie der Zinkmetalloproteasen. Diese hoch effizienten Enzyme können Kollagen vollständig abbauen. Sie erlauben es den Bakterien zum einen, Kollagen als Kohlenstoffquelle zu nutzen. Zum anderen erleichtern sie krankheitserregenden Stämmen die Invasion und Besiedelung des menschlichen Wirtes und die Verbreitung von Toxinen. Es überrascht daher nicht, dass diese Enzyme heute vielfach in Industrie, in Life-Science Forschung und in Kliniken verwendet werden. Angesichts der steigenden Zahl an multiresistenten Bakterienstämmen stellen diese Enzyme höchstinteressante Ziele für die Entwicklung neuartiger Antibiotika zur Bekämpfung klostridialer Infektionen (C. perfringens, C. histolyticum, C. tetanus, C. botulinum etc.) dar. Mangels hochauflösender Strukturdaten war und ist der Mechanismus des Kollagenabbaus durch bakterielle Kollagenasen bislang weitgehend unklar. Ein erster Durchbruch gelang uns mit der Aufklärung der Struktur der Kollagenaseeinheit von ColG aus C. histolyticum. Sie ermöglichte die Identifizierung und erste Charakterisierung der zwei minimalen Funktionseinheiten für Kollagen- und Peptidverdau. Darauf basierend konnten wir ein Zwei-Stufenmodell des bakteriellen Kollagenabbaus postulieren, gemäß dem die konzertierte Öffnung und Schließung der Kollagenaseeinheit die Prozessierung von tripel-helikalem Kollagen ermöglicht. Im Rahmen dieses Projekts wollen wir den genauen Mechanismus des Kollagenabbaus durch bakterielle Kollagenasen entschlüsseln. Dafür untersuchen wir die kleinste funktionelle Einheit, die Kollagen abbauen kann, die Kollagenaseeinheit mittels strukturbiologischer, biochemischer und biophysikalischer Methoden. Wir wollen wissen, wie die Kollagenaseeinheit (i) an die Kollagentriplehelix bindet, (ii) die Helix entwindet, und in Folge (iii) die einzelnen Stränge schneidet, und wir wollen herausfinden, welcher Dynamik das Enzym während der Katalyse unterliegt. Basierend auf diesen neuen Erkenntnissen werden wir in einem zweiten Schritt gezielt die Kollagenaseaktivität modifizierenundinhibieren. Dies wird entscheidend zur Entwicklung anwendungsspezifischer Kollagenasevarianten für Industrie, Medizin und Forschung beitragen, als auch die Entwicklung einer neuen Generation von Kollagenaseinhibitoren forcieren.

Kollagen ist das am häufigsten vorkommende Protein im Menschen. Kollagen ist enzymatisch nur sehr schwer abbaubar; nur wenige Enzyme können es spalten. Ein Grund dafür ist, dass Kollagen im Körper meist in großen unlöslichen Fibrillen vorkommt, aus denen ein einzelnes lösliches Kollagenmolekül erst für den enzymatischen Abbau herausgelöst werden muss. Danach muss das Enzym das herausgetrennte tripelhelikale Kollagenmolekül (Tropokollagen), das ähnlich wie ein Faden gewunden ist, entwinden und dessen einzelne -Ketten freilegen. Für die Spaltung der -Ketten muss das Enzym eine einzelne entfaltene -Kette in sein katalytisches Zentrum einpassen. Doch nur wenige Enzyme können die aufgrund ihrer hohen Dichte an Iminosäuren relativ starren -Ketten in ihrem aktiven Zentrum unterbringen. Daher gibt es nur eine Handvoll spezialisierter Enzyme, genannt Kollagenasen, die Kollagen abbauen können, wenn es richtig gefaltet bzw. im fibrillären Verbund vorliegt. Bakterien produzieren sehr effiziente Kollagenasen. Jedoch ist der Mechanismus ihres Kollagenabbaus noch nicht hinreichend erforscht. Diese bakteriellen Kollagenasen bestehen aus einem N-terminalen Kollagenasemodul, das eine zangenkopfartige Struktur besitzt, und einer variablen Anzahl an C-terminalen polycystic kidney disease-like Domänen (PKD) und Kollagenbindedomänen (CBD). Im Rahmen dieses vom FWF geförderten Projekts fanden wir heraus, dass bakterielle Kollagenasen primär mittels des Kollagenasemoduls und unterstützt von der Kollagenbindedomäne an Kollagen in seinen verschiedenen Formen (Fibrillen, Tropokollagen und Gelatine) binden, jedoch ohne die Hilfe der PKD-Domäne. Wir konnten zeigen, dass das Kollagenasemodul flexibel sein muss, um unlösliches Kollagen zu spalten, jedoch nicht um daran zu binden. Diese Flexibilität ist möglicherweise notwendig, um einzelne Kollagenmoleküle aus dem fibrillären Verbund herauszulösen. Überraschenderweise entdeckten wir mit Hilfe eines neu entwickelten Peptides für die Messung mittels Zirkulardichroismus, dass für die Aufgabe des Entfaltens von löslichem tripelhelikalem Kollagen nicht beide "Backen" der Kollagenaseeinheit benötigt werden, sondern nur eine, die sogenannte Aktivatordomäne. Mit Hilfe von Mutationsstudien konnten wir außerdem einzelne Aminosäurereste in der Aktivatordomäne identifizieren, die für die Bindung und die Entfaltung des Kollagens wichtig sind. Der durch die Aktivatordomäne vermittelte Entfaltungsmechanismus des Kollagens ist spezifisch für bakterielle Kollagenasen und ist in den Kollagenasen von Säugern nicht zu finden. Darüber hinaus konnten wir mit strukturellen und enzymatischen Studien zur Entwicklung und Charakterisierung von Inhibitoren gegen bakterielle Kollagenasen beitragen. Die Resultate dieser Studien werden hilfreich für die Entwicklung von Medikamenten gegen multiresistente pathogene Bakterien sein. Neben diesem Aspekt des Wirkstoffdesigns werden unsere Forschungsresultate aber auch dabei helfen, maßgeschneiderte Kollagenasen für unterschiedliche Anwendungen zu entwickeln. Derzeit werden bakterielle Kollagenasen beispielsweise in der Behandlung von Bindegewebserkrankungen (Dupuytren'sche Kontraktur und Peyronie-Krankheit) angewendet oder zur Isolierung von Inselzellen für die Behandlung von Diabetes eingesetzt.