Cathepsin L und SERPINA5 im Zellkern

In diesem Projekt wollen wir untersuchen, wie ein von Zellen internalisierter Protease-Inhibitor und ein normalerweise in Lysosomen lokalisiertes Enzym im Zellkern miteinander reagieren und welche Auswirkungen diese Reaktion auf das Protein-Muster im Zellkern hat. SERPINA5 (=Protein C Inhibitor) ist ein von Zellen sezerniertes Glykoprotein aus der Superfamilie der Serpine (Serinproteasen-Inhibitoren), das eine Vielzahl von extrazellulären, proteolytischen Enzymen durch Bildung stabiler Komplexe hemmt. Beim Menschen kommt SERPINA5 in den meisten Körperflüssigkeiten vor. Neuere Untersuchungen weisen darauf hin, dass SERPINA5 präventiv gegen malignes Tumorwachstum wirksam ist. Unter anderem hemmt SERPINA5 auch die Cystein-Protease Cathepsin L, die vorwiegend intrazellulär in Lysosomen vorkommt. SERPINA5 bindet Heparin- ähnliche Glykosaminoglykane und Phospholipide. Diese Moleküle, die auch Bestandteile der Zellmembran sind, modulieren die Hemmaktivität von SERPINA5 und sind an der Aufnahme von SERPINA5 durch Zellen beteiligt. Internalisiertes SERPINA5 kann in den Zellkern gelangen. Bisher sind sowohl der genaue (unkonventionelle) Mechanismus der Aufnahme von SERPINA5 durch die Zellmembran wie auch die Funktion von SERPINA5 im Zellkern unklar. Vorläufige Ergebnisse aus eigenen Untersuchungen mit Lymphoma Zellen weisen darauf hin, dass SERPINA5 auch im Zellkern mit Cathepsin L reagiert. Dieser Befund ist insoferne von Bedeutung, als Cathepsin L vorwiegend in Tumorzellen, nicht jedoch in normalen Zellen, im Kern lokalisiert ist und dort eine Reihe von Kernproteinen proteolytisch spaltet. Das könnte für das maligne Verhalten von Zellen von Bedeutung sein, da diese von Cathepsin L gespaltenen Proteine an der Regulation des Zellzykus und der DNA Reparatur beteiligt sind. Im vorliegenden Projekt wollen wir daher mittels Immuncytochemie und Proximity ligation assays untersuchen, unter welchen Bedingungen SERPINA5 und Cathepsin L im Kern co-lokalisiert sind und ob sie dort miteinander reagieren. Wir wollen weiters untersuchen, ob von außen internalisiertes SERPINA5 im Zellkern Cathepsin L hemmen kann. Wenn das der Fall ist, sollte es Auswirkungen auf das Protein-Muster im Zellkern haben. Wie wollen daher mittels Proteomics-Techniken (2D-DIGE und mass spectrometry) das Protein-Profil im Zellkern von SERPINA5 vorbehandelten Zellen mit jenem unbehandelter Zellen vergleichen. Zur Kontrolle werden wir dieselben Untersuchungen auch mit mutierten SERPINA5 Molekülen durchführen. Diese sind so verändert, dass sie entweder nicht internalisiert werden können, nicht in den Zellkern gelangen können oder keine Hemmaktivität haben. Weiters werden wir das Kern-Protein-Muster von Zellen untersuchen, die mit einem niedermolekularen Inhibitor von Cathepsin L, der Zell- und Kernmembran durchdringen kann, vorbehandelt wurden. Nach Validierung der Ergebnisse mittels 1- und 2-dimensionalen Western blots werden wir funktionelle Untersuchungen (z.B. Zellproliferation, Apoptose) durchführen, um die biologische Relevanz der Befunde zu ermitteln.

Ziel dieses Projekts war es, den Einfluss der Hemmung der Protease Cathepsin L auf die Funktionen und Proteinzusammensetzung einer Zelle zu untersuchen. Cathepsin L (CTSL) wird vermehrt in Tumorzellen gebildet und das vermehrte Vorkommen im Zellkern fördert das Wachstum von Tumorzellen. SERPINA5 ist ein sekretierter Serinprotease-Inhibitor, der nachweislich die enzymatische Aktivität von CTSL blockiert. In dieser Studie wurde eine umgekehrte Korrelation zwischen der SERPINA5 und CTSL-Expression als Funktion des Malignitätspotenzials gezeigt, wobei SERPINA5 in nicht malignen RWPE-1-Zellen in erhöhten Mengen exprimiert wurde, in Prostatakrebs-DU145-Zellen jedoch nur in geringen Mengen. Andersrum beobachteten wir eine hohe CTSL-Expression und fast kein SERPINA5 in DU145-Zellen. Basierend auf diesen Beobachtungen untersuchten wir, wie sich ein CTSL-Mangel auf die Zellphysiologie auswirkt, indem wir das CTSL-Gen in DU145-Zellen mithilfe der CRISPR/Cas-Methode ausschalten. Das Proteinrepertoire der CTSL-Knockout-DU145-Zellen wurde im Vergleich zu ihrem Wildtyp mithilfe zweier komplementärer Proteomik-Technologien untersucht: "Label-Free Shotgun" ein Bottom-up und zweidimensionale Fluoreszenz-in-Gel-Differentialgelelektrophorese "2D-DIGE". DIGE" eine Top-down Proteomics Methode. Die proteomische Untersuchung von Zytoplasma- und Kernextrakten von WT- und CTSL-KO-DU145-Zellen ergab, dass 156 von 1690 vollständig identifizierten Proteinen nur in Kernzellen vorhanden waren, während 517 von 2045 Proteinen nur in Zytoplasma derCTSL-KO-Zellen vorhanden waren. Beispielsweise wurden bei der Top-Down Proteomics-Methode erhebliche Mengen an Proteoformen von Cathepsinen mit einer erhöhten Menge des 22 kDa großen Cathepsin B-Spaltungsprodukts und des 27 kDa großen Cathepsin D-Spaltungsprodukts gefunden. Parallel dazu haben wir durch Shotgun-Proteomik auch eine erhöhte Expression des sequenzbasierten Vorläufers von CTSB in unseren CTSL-ko-DU145-Zellen festgestellt. Interessanterweise war in den CTSL KO DU145-Zellen auch eine verringerte Menge einer 42-kDa-Spaltungsproteoform der tumorspezifischen Variante der Pyruvatkinase, PKM2, nachweisbar. Diese 42 kDa große Proteoform von PKM2 wurde zuvor in Tumorzellen der Bauchspeicheldrüse gefunden und als enzymatisches Spaltprodukt von Cathepsin B identifiziert. Das 42 kDa große Spaltprodukt von PKM2 ist möglicherweise für eine verringerte enzymatische Aktivität und damit teilweise für die verringerte, durch den Zitronensäurezyklus vermittelte oxidative Phosphorylierung und damit die Umschaltung des Zellstoffwechsels auf Glukose verantwortlich, welche in Tumorzellen als Warburg-Effekt bekannt ist. Die Zellzyklusanalyse zeigte, dass sich DU145-Zellen überwiegend in der S-Phase befinden, wo die CTSL-Aktivität ebenfalls hoch ist, aber bei G2 immer noch erhöht ist. Als wir DU145-CTSL-Knockzellen im Vergleich zu WT-Zellen analysierten, stellten wir einen verringerten Prozentsatz an Zellen in der G2-Phase fest, wobei ein Anstieg von G1 mit einer beschleunigten Glykolyse verbunden war. Insgesamt bestätigten die Zellzyklusexperimente unsere proteomischen Ergebnisse für die CTSL-regulierte PKM2-Aktivität und weisen somit auf eine wesentliche Rolle von CTSL bei der Regulierung des Energiestoffwechsels und der Zellzykluskontrolle in DU145-Zellen hin.