Charakterisierung von humanem ANGEL2, der ersten beschrieben

RNA-Moleküle sind multifunktionale Schlüsselspielermit verschiedenenessentiellen biologischen Rollen. RNAs weisen insbesondere an ihren Enden alternative chemische Gruppen auf, die für ihr Schicksal und ihre Funktion entscheidend sind. Am 5`-Ende können RNAs eine einzelne oder dreifache Phosphatgruppe, oder anstelle eines Phosphats eine Hydroxy (OH)- Gruppe tragen. Boten-RNAs enthalten eine "Cap"-Struktur, eine Modifikation, die nach der Transkription hinzugefügt wird und essentiell für deren Stabilität und für die Translation in Proteine ist. Am 3`-Ende weisen RNAs oft eine OH-Gruppe auf. Durch de-novo-Synthese oder durch enzymatische Spaltungsprozesse enden jedoch einige RNAs mit einem zyklischen Phosphat an den Positionen 2` und 3`. Die de-novo-Synthese wird durch RTCD1, die "terminale 3` Phosphatzyklase", unter Verwendung eines 3`-Phosphats als Substrat katalysiert. Enzyme, die nach der Spaltung 2`,3`-zyklische Phosphate bilden, nehmen an Prozessen wie dem Prä-tRNA- Spleißen der Entfernung eines einzelnen Introns aus Vorläufer-tRNAs und an dem "Unfolded Protein Response" teil, die eine atypische mRNA-Spleißreaktion im Zytoplasma zur Folge hat. Unser Labor ist besonders an diesen Reaktionen interessiert. In diesem Antrag möchten wir die Biologie von 2`,3`-zyklischen Phosphat-terminierten RNAs untersuchen, da wir gerade eine neue enzymatische Aktivität aus menschlichen Zellen gereinigt und identifiziert haben, die 2`,3`-zyklische Phosphate in terminale 2`,3`-OH-Gruppen umwandelt. Das Enzym wird ANGEL2 genannt, und es wurde ursprünglich vorhergesagt, dass es eine andere Art einer enzymatischer Aktivität darstellt, nämlich die Entfernung von Adenosin aus Poly (A)- Schwänzen, die normalerweise an mRNA 3`-Enden vorhanden sind. Nach einer gründlichen biochemischen Charakterisierung von ANGEL2 wollen wir dessen Reaktionsmechanismus und dreidimensionale Struktur untersuchen. Wir planen auch RNA-Signalwege, die von ANGEL2 reguliert werden, zu identifizieren, und interagierende RNA-Moleküle und Proteine aufzudecken. Wir planen des Weiteren, die Funktion von ANGEL2 durch das Generieren von Mausmodellen zu untersuchen, denen das Angel2-Gen fehlt oder die größere Proteinmengen davon herstellen. Schließlich werden wir nach Patienten mit ANGEL2-Mutationen forschen und versuchen, deren Symptome auf molekularer Ebene zu verstehen. Die enzymatische Aktivität von ANGEL2, welche 2`,3`-zyklische Phosphate in 2`,3`-OH umwandelt, wird auch für die Sequenzierung von 2`,3`- zyklischen Phosphat-terminierten RNAs nützlich sein, die refraktär gegenüber dem Klonieren mit Standardverfahren sind. Zusammengefasst ist ANGEL2 ein neues und einzigartiges RNA-prozessierendes Enzym in Säugetierzellen. Es ist unerlässlich, seine Funktion auf molekularer Ebene im Kontext der Zelle zu verstehen.

Das zentrale Dogma der Molekularbiologie besagt, dass DNA in mRNA-Moleküle umgeschrieben wird, die wiederum in Proteine, die Arbeitspferde einer Zelle, übersetzt werden. Wissenschaftler haben diese scheinbar einfache Ereigniskette mit bahnbrechenden Erkenntnissen und zahlreichen Details "ausgeschmückt". So weiß man zum Beispiel, dass nicht alle RNAs, die durch Transkription aus der DNA entstehen, zur Bildung von Proteinen verwendet werden; einige RNA-Moleküle führen ein Eigenleben. Es ist auch bekannt, dass RNAs eine Vielzahl von chemischen Modifikationen durchlaufen, bevor sie für die Zelle nützlich werden. Das Projekt, mit dem ich mich in den letzten vier Jahren beschäftigt habe, konzentrierte sich auf eine einzige chemische Modifikation, die einige RNA-Moleküle am letzten Nukleotid aufweisen, und auf das Enzym, das es erkennt, mit ihm reagiert und es in eine andere chemische Gruppe umwandelt, mit auffallend unterschiedlichen biochemischen und biologischen Eigenschaften. Das Enzym heißt ANGEL2 und wurde in meinem Labor entdeckt. Das Besondere an unserer Entdeckung ist, dass ANGEL2 nicht das tut, was andere Wissenschaftler aufgrund seiner Ähnlichkeit mit anderen, recht ähnlichen Enzymen vermuteten. Im Rahmen dieses Projekts haben wir den Wirkmechanismus von ANGEL2 auf atomarer Ebene entschlüsselt. Zusammen mit Prof. Martin Jinek von der Universität Zürich ist es uns sogar gelungen, ein dreidimensionales Bild von ANGEL2 mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse zu gewinnen. Unser biochemisches und Prof. Jineks Fachwissen bezüglich Proteinstrukturen bildeten eine große Synergie, um schließlich die molekularen Mechanismen von ANGEL2 aufzuklären. Dazu haben wir einen alten Trick angewandt: Wir haben es geschafft, Zellen ohne ANGEL2 zu erzeugen. Diese Zellen sind lebend, aber sie sind nicht in der Lage, einige spezifische Aufgaben in der Zelle zu erfüllen, wie wir erwartet hatten. Allerdings - und diese Experimente dauern noch an - scheinen sowohl die Maus als auch ein kleiner, durchsichtiger Fisch, Danio rerio oder "Zebrafisch" genannt, ein normales Leben ohne ANGEL2 zu führen! Vor kurzem haben wir zusammen mit einer anderen Gruppe herausgefunden, dass ANGEL2 die meiste Zeit in einem ganz besonderen "Raum" der Zelle, den Mitochondrien, verbringt, wo die Energie für die Zelle produziert wird. ANGEL2 wird über einen sehr präzisen Mechanismus in die Mitochondrien "importiert", und auch diesen Aspekt haben wir seziert. Wir sind weiter gegangen und haben ein Protein identifiziert, das ANGEL2 sehr stark bindet, und wir untersuchen derzeit die Eigenschaften und den Zweck einer solchen Interaktion. Dieses Projekt umfasste viele weitere Experimente, die in dieser Zusammenfassung nicht dargestellt werden können; in der Tat ist jeder Satz die Spitze eines Eisbergs. Ich kann jedoch sagen, dass wir ein neues Enzym in menschlichen Zellen entdeckt und sehr detailliert charakterisiert haben, und das ist ein Grund zum Feiern! Die Entdeckung wurde im Science Magazine veröffentlicht, was dessen Bedeutung widerspiegelt.